非小細(xì)胞肺癌組織中Ezrin、Snail蛋白表達(dá)及意義

李米紅，廖子君，張彥兵，李旭，徐瑞，李麗娜，胡雪玲，郭亞煥

(1陜西師范大學(xué)學(xué)府醫(yī)院，西安710062；2陜西省腫瘤醫(yī)院)

·臨床研究·

非小細(xì)胞肺癌組織中Ezrin、Snail蛋白表達(dá)及意義

李米紅1，廖子君2，張彥兵2，李旭2，徐瑞2，李麗娜2，胡雪玲2，郭亞煥2

(1陜西師范大學(xué)學(xué)府醫(yī)院，西安710062；2陜西省腫瘤醫(yī)院)

目的探討Ezrin和Snail蛋白在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中的表達(dá)和臨床意義。方法選擇80例NSCLC患者，取手術(shù)切除的腫瘤組織和癌旁正常肺組織，應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)Ezrin和Snail蛋白表達(dá)水平，分析Ezrin和Snail蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，并分析兩者的相關(guān)性。結(jié)果肺癌和正常肺組織中Ezrin蛋白的高表達(dá)率分別為47.5%和17.5%，Snail蛋白的高表達(dá)率分別為51.3%和12.5%，肺癌組織中Ezrin和Snail蛋白的高表達(dá)率均高于正常組織(P均<0.01)。Ezrin、Snail蛋白表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均<0.01)。Ezrin與Snail蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(γ=0.327，P=0.003)。結(jié)論Ezrin和Snail蛋白表達(dá)增高可能在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，聯(lián)合檢測(cè)Ezrin和Snail蛋白表達(dá)可以作為判斷病情的生物學(xué)指標(biāo)。

非小細(xì)胞肺癌；Ezrin蛋白；Snail蛋白；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

肺癌中約80%的患者為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)[1]。由于早期癥狀不容易被發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)肺癌患者在就診時(shí)已處于中晚期，預(yù)后極差。腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌患者死亡的主要原因。Ezrin蛋白是一種膜細(xì)胞骨架連接蛋白，可與細(xì)胞表面受體或黏附分子相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的黏附性，調(diào)控腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[2，3]。Snail蛋白是鋅指轉(zhuǎn)錄因子超家族的之一，能夠調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，而EMT在腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[4，5]。本研究通過檢測(cè)NSCLC組織中Ezrin和Snail蛋白的表達(dá)情況，探討二者在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2013年1月～2015年1月陜西省腫瘤醫(yī)院收治的NSCLC患者80例，男57例、女23例，年齡39～73歲、中位年齡60歲。取手術(shù)切除(不可手術(shù)患者通過支氣管鏡檢或CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺獲取腫瘤組織標(biāo)本)的腫瘤組織，病理檢查顯示分化程度高分化19例、中分化32例、低分化29例，病理類型鱗癌38例、腺癌42例，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期42例、Ⅲ～Ⅳ期38例，合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例。另取癌旁正常肺組織標(biāo)本40例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，獲得患者及家屬知情同意。

1.2 Ezrin和Snail蛋白檢測(cè)方法 采用免疫組化法。取石蠟組織切片，60 ℃烘箱內(nèi)烘烤60 min，加入二甲苯溶液脫蠟，不同梯度乙醇脫水，3%過氧化氫去離子水封閉，室溫下孵育15 min。高壓熱修復(fù)切片，滴加山羊血清，37 ℃孵育40 min。滴加一抗(抗人Ezrin或Snail抗體)，4 ℃冰箱中孵育過夜；滴加二抗，37 ℃孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察。取已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。由2位病理科醫(yī)生觀察染色情況，并采用盲法獨(dú)立閱片。Ezrin和Snail均定位于細(xì)胞質(zhì)，以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色均勻染色定義為陽(yáng)性表達(dá)。先在200倍鏡下選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性染色的細(xì)胞數(shù)，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比進(jìn)行評(píng)分，0%為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；然后對(duì)染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，無(wú)染色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積0～3為低表達(dá)，≥4為高表達(dá)[6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法進(jìn)行分析，相關(guān)性分析行Spearman檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌和正常肺組織中Ezrin蛋白表達(dá)比較 肺癌和正常肺組織中Ezrin蛋白的高表達(dá)率分別為47.5%(38/80)、17.5%(7/40)，Snail蛋白的高表達(dá)率分別為51.3%(41/80)和12.5%(5/40)，肺癌組織中Ezrin和Snail蛋白的高表達(dá)率均高于正常肺組織(P均<0.01)。

2.2 Ezrin、Snail蛋白表達(dá)與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 Ezrin、Snail蛋白表達(dá)與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.01)，而與年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度、病理分型無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見表1。

表1 Ezrin、Snail蛋白表達(dá)與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3 Erin和Snail蛋白在肺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 肺癌組織中，Erin和Snail蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.327，P<0.01)。

3 討論

EMT是細(xì)胞從上皮向間皮表型轉(zhuǎn)化的過程，其特征是上皮標(biāo)志物如細(xì)胞表面黏附分子的丟失和間皮標(biāo)志物的過表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移中發(fā)揮重要作用[7]。Ezrin蛋白為膜細(xì)胞骨架連接蛋白，通過與表面受體或黏附分子相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的黏附性，從而調(diào)控腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。其中的機(jī)制主要包括以下兩方面：①Ezrin蛋白可通過激活Rac-1蛋白，將E-鈣黏蛋白從細(xì)胞膜位置募集到細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞膜E-鈣黏蛋白的缺失破壞了細(xì)胞間的連接，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的脫落。②高表達(dá)的Ezrin蛋白可阻止細(xì)胞質(zhì)的E-鈣黏蛋白向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致E-鈣黏蛋白在細(xì)胞膜表面分布減少，間接減少腫瘤細(xì)胞之間的連接，從而使腫瘤細(xì)胞易脫離腫瘤原發(fā)灶而發(fā)生轉(zhuǎn)移。Ezrin蛋白也通過參與細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)部的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控轉(zhuǎn)移過程[3，8，9]。陳清勇等[6]報(bào)道，肺癌組織中Ezrin蛋白表達(dá)高于癌旁正常組織；與低轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞系比較，高轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞系中Ezrin mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高；Ezrin蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。除了在肺癌中的研究以外，在其他類型的腫瘤組織中也有類似的發(fā)現(xiàn)。Ezrin目前被發(fā)現(xiàn)與乳腺癌的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移以及血管生成的過程有關(guān)[10]。Ezrin高表達(dá)與骨肉瘤分化程度低以及預(yù)后差有明顯的相關(guān)性[11]。本研究結(jié)果顯示，Ezrin蛋白在肺癌組織中的表達(dá)高于正常肺組織，Ezrin高表達(dá)與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。提示Ezrin蛋白對(duì)肺癌的發(fā)展具有促進(jìn)作用。

研究顯示，Snail蛋白通過調(diào)控EMT在腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。Snail作為EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子之一，調(diào)控E-鈣黏蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)也是EMT發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵因子[12]，而E-鈣黏蛋白表達(dá)的缺失是EMT的關(guān)鍵步驟。在發(fā)生EMT的過程中，Snail蛋白與E-鈣黏蛋白的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，使其表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞之間的黏附力下降，侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn),與正常肺組織比較，Snail蛋白在肺癌組織表達(dá)顯著增高，Snail表達(dá)增高與較晚的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著的相關(guān)性。目前研究發(fā)現(xiàn)Snail在肺癌、乳腺癌、食管鱗癌等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)[13，14]，并與腫瘤的組織學(xué)類型、病理分級(jí)、侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)后等有關(guān)。Ezrin與細(xì)胞表面分子相互作用，共同調(diào)節(jié)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的各個(gè)環(huán)節(jié)。我們進(jìn)一步分析了Ezrin蛋白和Snail蛋白表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)肺癌Ezrin蛋白和Snail蛋白表達(dá)具有顯著的正相關(guān)性。綜合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為，Ezrin和Snail蛋白表達(dá)增高可能在NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。Ezrin蛋白和Snail蛋白可能成為肺癌的分子標(biāo)志物，其高表達(dá)提示患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性較大，同時(shí)也可以成為NSCLC治療的生物靶點(diǎn)。Snail蛋白通過下調(diào)E-鈣黏蛋白的表達(dá)，促進(jìn)EMT發(fā)生。Ezrin蛋白通過激活Rac-1蛋白，下調(diào)細(xì)胞膜E-鈣黏蛋白表達(dá)。推測(cè)Ezrin可能也參與了EMT的發(fā)生，這種作用可能與Snail蛋白相關(guān)。

綜上所述，Snail蛋白和Ezrin蛋白在NSCLC組織中表達(dá)增高，二者表達(dá)呈正相關(guān)，提示Snail蛋白和Ezrin蛋白可能在肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮相似的促癌作用，二者聯(lián)合檢測(cè)可能成為判斷肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物學(xué)指標(biāo)。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.42.015

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陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013JM402)。

郭亞煥(E-mail: 277962686@qq.com)

2017-06-04)