載辛伐他汀/納米羥基磷灰石膠原復合組織工程材料對大鼠牙槽骨缺損的修復作用

許瑩瑩，王敬，韓尚志，張興樂，王鵬，時靜華,李石巖

(1承德醫學院附屬醫院，河北承德067000；2 承德市中心醫院)

載辛伐他汀/納米羥基磷灰石膠原復合組織工程材料對大鼠牙槽骨缺損的修復作用

許瑩瑩1，王敬1，韓尚志1，張興樂1，王鵬1，時靜華1,李石巖2

(1承德醫學院附屬醫院，河北承德067000；2 承德市中心醫院)

目的觀察載辛伐他汀/納米羥基磷灰石膠原(NHAC)復合組織工程材料對大鼠牙槽骨缺損的修復作用。方法將45只大鼠隨機分為載辛伐他汀/NHAC組、NHAC組、空白組各15只，均于下頜右側制備骨缺損區，分別植入載辛伐他汀/NHAC材料、植入NHAC材料、不植入材料，于術后2、4、8周分別取5只大鼠觀察大體情況，使用鉬靶攝影機檢測切牙拔牙窩的骨密度，HE染色觀察頜骨組織病理學表現，顯微鏡下觀察植骨區域骨小梁形成情況，計算新骨形成面積占視野總面積的百分比。結果3組術后均無骨折發生，傷口無感染、壞死，創口愈合良好、無開裂，黏膜平整，色澤正常。3組術后2、4、8周下頜骨缺損區骨密度均隨時間延長逐漸升高(P均<0.05)；載辛伐他汀/NHAC組術后2、4、8周下頜骨缺損區骨密度均高于NHAC組、空白組(P均<0.05)。載辛伐他汀/NHAC組術后2周拔牙窩骨壁鄰近區域即有少量新骨形成，4周時新生骨增加并有骨島形成，8周時新生骨沉積線明顯，骨小梁致密，數量多；NHAC組術后2周可見較稀疏的編織骨，周圍可見成骨細胞，4周時可見較密集新生骨，8周時可見新生骨沉積線；空白組術后2周有少量新骨形成伴有炎性細胞浸潤，4周時形成的新骨較少且分散，伴有炎性細胞浸潤，8周時有較多骨小梁形成，牙槽窩內骨小梁較稀疏。3組術后2、4、8周新生成骨面積百分比隨時間延長逐漸升高(P均<0.05)；載辛伐他汀/NHAC組術后2、4、8周新生成骨面積百分比均高于NHAC組、空白組(P均<0.05)。結論載辛伐他汀/NHAC復合組織工程材料可以促進牙槽骨缺損的修復，增加骨密度，促進新骨形成。

辛伐他汀；納米羥基磷灰石；復合組織工程材料；牙槽骨；骨缺損；骨修復;大鼠

牙槽骨缺損主要由腫瘤、外傷、先天發育畸形、牙周病等原因造成，不僅影響患者的語言、牙齒咬合功能，也影響正畸牙齒的移動[1，2]。近年來，引導骨再生技術在骨缺損的修復中得到廣泛應用。該技術是利用生物材料制成的生物膜，在牙齦軟組織與骨缺損之間人為地豎起一道生物膜屏障，阻止軟組織中成纖維細胞及上皮細胞長入骨缺損區，確保成骨過程在無上皮及成纖維細胞等優勢生長細胞干擾的前提下逐漸完成，最后實現缺損區完全的骨修復[3，4]。納米羥基磷灰石膠原(NHAC)是利用納米技術在納米結構單元或納米數量級下生產的新型仿生骨材料，具有優越的生物相容性和生物活性，無細胞毒性，能促進和加快骨的愈合。另有研究[5,6]顯示，載辛伐他汀支架材料不僅能夠提高辛伐他汀的生物利用度，還可以降低其不良反應。2016年5～12月，我們觀察了載辛伐他汀/NHAC復合組織工程材料對大鼠牙槽骨缺損的修復作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級Wistar雄性大鼠45只，體質量(200±20)g，購于山東魯抗醫藥股份有限公司。于室溫20～25 ℃、濕度50%～60%條件下適應性飼養1周，自由進食、飲水。NHAC復合材料由清華大學材料科學與工程學系研發，北京奧精生物醫藥科技有限公司提供。載辛伐他汀/NHAC復合組織工程材料的合成：將辛伐他汀與NHAC按照一定比例混合均勻，攪拌后再進行交聯處理，最后冷凍干燥得到支架材料。

1.2 動物分組與模型制備 將大鼠按隨機數字表法分為載辛伐他汀/NHAC組、NHAC組、空白組，每組15只。采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，于下頜右側制備缺損區。局部注射2%利多卡因加0.1%鹽酸腎上腺素，完整拔除右下頜中切牙，慢速柱形裂鉆配合生理鹽水沖洗降溫。在拔牙窩基礎上頰舌向、近遠中向擴展牙槽窩，制備箱型缺損區域。修整平齊缺損區域上緣，消除尖銳骨嵴。骨缺損區制備完畢后，載辛伐他汀/NHAC組植入載辛伐他汀/NHAC材料，NHAC組植入NHAC材料，空白組不植入材料。3組均行褥式縫合加固骨膜，間斷縫合牙齦，創口縫合嚴密、平整、骨膜無外露，生理鹽水局部沖洗。術后7 d肌注青霉素40萬U/d預防感染。

1.3 標本采集及處理 于術后2、4、8周3組分別隨機取5只大鼠，采用10%水合氯醛0.5 g/kg腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛心臟灌注進行固定。固定完全后，分離下頜骨，置于4%多聚甲醛內加強固定24 h。

1.4 觀察指標

1.4.1 大體情況 觀察術區表面牙齦上皮愈合情況，檢查是否存在骨折、感染、壞死、瘺道等；切開軟組織，觀察植骨區表面愈合情況。

1.4.2 下頜骨缺損區骨密度 采用MAMMOMAT3000型鉬靶攝影機對下頜骨標本進行攝影，設置參數為電壓29 kV、曝光量8～11 mA。掃描圖像，采用專業圖像分析軟件Image Pro Plus v6對大鼠下頜骨缺損區的灰度值進行分析，以灰度值表示骨密度。

1.4.3 下頜骨組織形態 將下頜骨標本放入10% EDTA溶液中脫鈣，垂直于下頜骨長軸，切取從下頜第一磨牙近中鄰面至其遠中3 mm處的、連同部分下頜第一磨牙的頜骨組織塊，常規脫水、浸蠟、包埋、切5 μm厚切片，HE染色，光鏡下觀察。

1.4.4 新生成骨面積百分比 取下頜骨組織標本切片，低倍鏡下觀察缺損區新骨形成情況；計算機采集圖像，通過軟件測定新骨形成面積占視野總面積的百分比。

2 結果

2.1 各組大體情況 術后各組大鼠均無骨折發生，傷口無感染、壞死，創口愈合良好、無開裂。黏膜平整，色澤正常。

2.2 各組下頜骨缺損區骨密度比較 術后2、4、8周，載辛伐他汀/NHAC組下頜骨缺損區骨密度均高于NHAC組和空白組，NHAC組高于空白組(P均<0.05)。組內不同時間點比較，NHAC組和空白組術后8周時的下頜骨缺損區骨密度均高于術后2、4周時，術后4周時高于術后2周時(P均<0.05)；載辛伐他汀/NHAC組2、4、8周時下頜骨缺損區骨密度比較無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組術后不同時間點下頜骨缺損區骨密度比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與NHAC組比較，#P<0.05；與術后2周比較，▲P<0.05；與術后4周比較，△P<0.05。

2.3 各組下頜骨組織形態學比較 術后2周，載辛伐他汀/NHAC組拔牙窩骨壁鄰近區域有少量新骨形成；NHAC組可見較稀疏的編織骨，周圍可見成骨細胞；空白組有少量新骨形成伴有炎性細胞浸潤。術后4周，載辛伐他汀/NHAC組牙槽窩內可見新生骨增加，并有骨島形成；NHAC組牙槽窩內可見較密集新生骨；空白組形成的新骨較少且分散，僅限于牙槽窩骨壁附近，伴有炎性細胞浸潤。術后8周，載辛伐他汀/NHAC組較NHAC組新生骨沉積線明顯，骨小梁致密，數量多；空白組牙槽窩周邊有較多骨小梁形成，牙槽窩內骨小梁較稀疏。

2.4 各組新生成骨面積百分比比較 術后2、4、8周，載辛伐他汀/NHAC組新生成骨面積百分比均高于NHAC組和空白組，NHAC組高于空白組(P均<0.05)。組內不同時間點比較，載辛伐他汀/NHAC組和NHAC組術后8周時的新生成骨面積百分比均高于術后2、4周，術后4周高于術后2周(P均<0.05)；空白組新生成骨面積百分比術后2、4、8周比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組不同時間新生成骨面積百分比比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與NHAC組比較，#P<0.05；與術后2周比較，▲P<0.05；與術后4周比較，△P<0.05。

3 討論

牙齒拔除后，牙槽嵴可發生持續性、進行性、不可逆性的骨吸收，常造成牙槽嵴低平或呈刃狀，給義齒修復或種植體植入造成困難[7，8]，影響機體的咀嚼功能。骨組織工程在治療骨缺損方面具有顯著優勢，支架材料作為骨組織工程的重要組成部分，其相關研究越來越多[11，12]。人工支架材料具有優良的生物相容性、骨引導性和生物可降解性，易于塑形及臨床操作。辛伐他汀具有促進骨形成、增加骨強度、刺激成骨細胞分化、加快骨重建時間等作用，通過擴散、滲透方式，到達牙槽骨骨組織缺損區域，具有較弱的緩釋效應，可較快地發揮藥效，增加牙槽窩內骨密度，刺激成骨細胞分化，促進新骨形成，修復牙槽骨骨組織缺損。但口服辛伐他汀在骨組織的利用率遠遠達不到骨形成部位所需要的劑量，而局部大量注射辛伐他汀又具有細胞毒性[13，14]，且由于他汀類藥物擴散快，半衰期短，需要反復注射才能獲得理想藥效，患者難以接受。因此，優化辛伐他汀的給藥途徑對提高其促進骨形成效果、減少不良反應至關重要。NHAC是以納米晶膠原基骨為材料，由于羥基磷灰石的晶體結構、成分與人骨無機礦物成分基本相同，因此具有良好的生物相容性；而多孔的羥基磷灰石因其孔隙可增加成骨細胞、生長因子黏附、增殖的表面積，更利于纖維血管再生，因此具有更好的生物活性；納米級的羥基磷灰石表面積更大，可黏附更多的細胞；同時具有表面效應及體積效應，在力學和生物學方面有很大的優越性和應用潛力。載辛伐他汀/NHAC結合兩者的優勢，經擴散和滲透等環節釋放出來辛伐他汀，這個釋放程度持續，且始終接近勻速，促進成骨的效果更加明顯，通過持續、有效地釋放，為新骨的形成提供誘導因子，又能為新骨生長提供支架，兼具骨傳導和骨誘導的雙重作用，牙槽窩的骨密度逐漸提高，新生的骨小梁逐漸增多、增寬。

骨密度全稱是骨骼礦物質密度，是骨骼強度的一個重要指標。拔牙窩的愈合過程主要表現為血凝塊的機化，成骨細胞分化、成熟，骨基質的分泌、礦化，類似于骨組織缺損的修復過程[15，16]。因此，檢測骨密度能反映骨的愈合程度。本研究結果顯示，3組術后2、4、8周拔牙窩骨密度組間比較差異均有統計學意義，載辛伐他汀/NHAC組術后2、4、8周拔牙窩骨密度均高于NHAC組和空白組，表明載辛伐他汀/NHAC更有利于骨組織缺損的修復。

研究表明，拔牙窩組織的病理學特征變化的趨勢與骨密度改變的情況相對應。本研究結果顯示，各組下頜切牙拔牙窩內新生骨小梁的大小、密度隨時間延長逐漸增加，載辛伐他汀/NHAC組的組織學情況最佳，提示載辛伐他汀/NHAC修復骨組織缺損的效果最佳。新生成骨面積百分比是新骨形成的指標，能直接反映骨的修復情況。本研究結果顯示，載辛伐他汀/NHAC組術后2、4、8周新生成骨面積百分比均高于NHAC組和空白組，表明載辛伐他汀/NHAC與NHAC比較，更能促進新骨的形成。

綜上所述，載辛伐他汀/NHAC復合組織工程材料容易制備，操作簡便，能夠通過穩定地釋放藥物為新骨的形成提供誘導因子，又能為新骨生長提供支架，促進新骨形成，從而促進牙槽骨缺損的修復。

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