IL-37對(duì)人原代髓樣樹突狀細(xì)胞炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響

吳萬(wàn)通，崔兆娜

(1天津市東麗區(qū)東麗醫(yī)院，天津300300；2天津市河西區(qū)陳塘莊街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心)

IL-37對(duì)人原代髓樣樹突狀細(xì)胞炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響

吳萬(wàn)通1，崔兆娜2

(1天津市東麗區(qū)東麗醫(yī)院，天津300300；2天津市河西區(qū)陳塘莊街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心)

目的觀察白細(xì)胞介素37(IL-37)對(duì)人原代髓樣樹突狀細(xì)胞(mDC)表達(dá)炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-6、IL-12的影響。方法使用淋巴細(xì)胞分離液將全血細(xì)胞分離后提取單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞分選方法分離純化CD11c+CD123lowHLA-DR+的mDC。將分選后的mDC分為3組：未處理組加入完全培養(yǎng)基；對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再加入100 ng/mL LPS；IL-37預(yù)處理組分別加入0.125、0.25、0.5、1 μg/mL IL-37后，再加入100 ng/mL LPS。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)mDC中TNF-α、IL-6、IL-12 mRNA表達(dá)，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-12水平。結(jié)果與未處理組比較，對(duì)照組TNF-α、IL-6、IL-12 mRNA表達(dá)均升高(P均<0.01)。與對(duì)照組相比，IL-37預(yù)處理組加入0.25、0.5、1 μg/mL IL-37預(yù)處理后，TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)降低；加入0.5、1 μg/mL IL-37預(yù)處理后，IL-12 mRNA表達(dá)降低(P均<0.01)。與未處理組比較，對(duì)照組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-12水平升高。各濃度IL-37預(yù)處理組與對(duì)照組相比，TNF-α水平均降低(P均<0.05)；加入0.25 μg/mL IL-37預(yù)處理后，細(xì)胞上清液中IL-6、IL-12水平降低(P均<0.05)。結(jié)論IL-37能夠降低人原代mDC表達(dá)和分泌炎癥相關(guān)因子。

白細(xì)胞介素37；髓樣樹突狀細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)；腫瘤壞死因子α；白細(xì)胞介素6；白細(xì)胞介素12

髓樣樹突狀細(xì)胞(mDC)是一群專職的抗原提呈細(xì)胞，它能夠捕獲、加工并通過(guò)其表面受體提呈抗原給T細(xì)胞。mDC是適應(yīng)性免疫反應(yīng)和固有免疫反應(yīng)的橋梁[1]。白細(xì)胞介素37(IL-37)在人類體內(nèi)大多數(shù)類型的細(xì)胞中均有表達(dá)，包括單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞，并能夠調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。體外研究[2]表明，表達(dá)在巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞的IL-37能抑制促炎性細(xì)胞因子IL-1α、IL-1β、TNF-α和巨噬細(xì)胞炎性蛋白2(MIP-2)的產(chǎn)生。體內(nèi)研究[3]表明，小鼠體內(nèi)IL-37表達(dá)能夠保護(hù)機(jī)體,抵抗化學(xué)誘導(dǎo)型結(jié)腸炎和代謝綜合征。此外，IL-37轉(zhuǎn)基因小鼠在內(nèi)毒素休克中能夠降低肺、腎、肝損傷[2]。盡管IL-37在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要功能，但其對(duì)人原代mDC的免疫學(xué)作用尚不清楚。2015年12月～2016年11月，我們觀察了IL-37對(duì)人原代mDC炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-6、IL-12表達(dá)的影響，為探討其在疾病發(fā)病中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 脂多糖購(gòu)自Sigma公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)?yáng)生物制品公司；IL-37購(gòu)自R&D公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；恒溫培養(yǎng)箱和cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，熒光標(biāo)記的抗人抗體(Lin-FITC、CD123-PE、HLA-DR-PerCP、CD11c-APC)購(gòu)自BD公司。BD FACSAriaⅢ流式細(xì)胞分選儀購(gòu)自BD公司；人IL-6、IL-12、TNF-α、GAPDH cDNA擴(kuò)增引物由上海生物工程有限公司負(fù)責(zé)合成，人IL-6、IL-12、TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)自深圳欣博勝生物有限公司。

1.2 單個(gè)核細(xì)胞的提取 采集體檢正常產(chǎn)婦枸櫞酸鈉抗凝臍血約100 mL，與等量PBS充分混勻。在50 mL離心管中加入淋巴細(xì)胞分離液20 mL，用移液管吸取30 mL已稀釋的全血，沿離心管管壁緩慢加入，保持兩液面界面清晰。離心，吸取中上層單個(gè)核細(xì)胞，放入離心管中，加入2倍體積PBS，洗滌去除血小板及殘留的淋巴細(xì)胞分離液。將細(xì)胞稀釋成1×107/mL，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)分選CD11c+CD123lowHLA-DR+的mDC 取單個(gè)核細(xì)胞，離心后加入200 μL 1% PBS，重懸后依次加入熒光標(biāo)記抗體Lin-FITC、CD123-PE、HLA-DR-PerCP、CD11c-APC，混勻細(xì)胞后冰浴避光反應(yīng)30～40 min。PBS洗滌，去除多余的游離抗體。離心重懸后上機(jī)分選。在配置的15 mL分選接收管內(nèi)加入3 mL 1% PBS及青霉素-鏈霉素溶液，收集目的細(xì)胞。離心，去上清后重懸。使用流式分選儀軟件分析細(xì)胞表型。基于外周血單個(gè)核細(xì)胞的自身特點(diǎn)，通過(guò)FSC-A/SSC-A散點(diǎn)圖結(jié)果排除待測(cè)樣本中的死細(xì)胞和碎片即為總PBMC。基于Lin/CD123散點(diǎn)圖，在總PBMC中圈出Lin-CD123low的細(xì)胞。進(jìn)一步基于CD11c/HLA-DR散點(diǎn)圖，在Lin-CD123low細(xì)胞中，找到CD11c、HLA-DR雙陽(yáng)性細(xì)胞，圈出CD11c+/HLA-DR+細(xì)胞即為mDC(Lin-CD123lowHLA-DR+CD11c+)，使用流式細(xì)胞分選儀進(jìn)行分選，收集mDC。

1.4 mDC體外刺激培養(yǎng) 將分選后的mDC按1×106/孔接種于12孔板中，分為3組：未處理組加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，加入100 ng/mL LPS繼續(xù)培養(yǎng)24 h；IL-37預(yù)處理組分別加入0.125、0.25、0.5、1 μg/mL IL-37處理24 h后，再加入100 ng/mL LPS培養(yǎng)24 h。5% CO2條件下37 ℃培養(yǎng)，收集mDC及培養(yǎng)基上清。

1.5 mDC中TNF-α、IL-6、IL-12 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法。收集3組細(xì)胞，采用TRIzol總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。ABI7500儀器上進(jìn)行Real time PCR反應(yīng)。引物序列：GAPDH上游引物為5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′，下游引物為5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′； TNF-α上游引物為5′-CTCTTCTGCCTGCTGCACTTTG-3′，下游引物為5′-ATGGGCTACAGGCTTGTCACTC-3′；IL-6上游引物為5′-GCCCATGCTACATTTGCCGAAG-3′，下游引物為5′-CAGGAGCCCAGCTATGAACTC-3′；IL-12上游引物為5′-GACATTCTGCGTTCAGGTCCAG-3′，下游引物為5′-CATTTTTGCGGCAGATGACCGTG-3′。PCR體系為20 μL：Transgen 2×SYBR Green RT-PCR Master MIX 10 μL；Primers 2 μL；cDNA 1 μL；DEPC水7 μL。按以下條件進(jìn)行Real time PCR擴(kuò)增：95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)40次。儀器記錄熒光值，擴(kuò)增結(jié)束后繪制溶解曲線。目的基因的表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.6 細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-12水平檢測(cè) 采用ELISA法。收集3組細(xì)胞的上清液，采用ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-12水平，依據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 各組mDC中TNF-α、IL-6、IL-12 mRNA表達(dá)比較 與未處理組相比，對(duì)照組TNF-α、IL-6、IL-12 mRNA表達(dá)均升高(P均<0.01)。與對(duì)照組相比，IL-37預(yù)處理組加入0.125 μg/mL IL-37預(yù)處理后，TNF-α、IL-6、IL-12 mRNA表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；當(dāng)加入0.25、0.5、1 μg/mL IL-37預(yù)處理后，TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)降低(P均<0.01)；當(dāng)加入0.5、1 μg/mL IL-37預(yù)處理后，IL-12 mRNA表達(dá)降低(P均<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組mDC中TNF-α、IL-6、IL-12 mRNA表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01。

2.2 各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-12水平比較 與未處理組比較，對(duì)照組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-12水平升高。各濃度IL-37預(yù)處理組與對(duì)照組相比，TNF-α水平均降低(P均<0.05)；加入0.125 μg/mL IL-37預(yù)處理后，細(xì)胞上清液中IL-6、IL-12水平無(wú)明顯變化(P均>0.05)；加入0.25、0.5、1 μg/mL IL-37預(yù)處理后，細(xì)胞上清液中IL-6、IL-12水平降低(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-12表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

IL-37的抗炎作用已在多種不同種類的細(xì)胞中得到證明[2，4，5]。外源性IL-37通過(guò)與IL-18受體的α鏈結(jié)合，發(fā)揮抑制炎癥的作用[6]。此外，細(xì)胞內(nèi)IL-37可轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核,以下調(diào)促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[7]。IL-37能在體外和體內(nèi)廣泛抑制固有免疫反應(yīng)。重組IL-37已被證明能減少肝細(xì)胞損傷引起的缺血和再灌注損傷[8]。此外，重組IL-37能保護(hù)小鼠抵抗急性肺損傷和降低氣管內(nèi)滴注煙曲霉菌后的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)[9]。轉(zhuǎn)染IL-37的間充質(zhì)干細(xì)胞已被證明能通過(guò)增加髓源性抑制和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞并降低CD4+細(xì)胞數(shù)量來(lái)保護(hù)小鼠抵抗結(jié)腸炎[10]。

雖然大量研究均顯示IL-37可能會(huì)降低炎癥因子的表達(dá)，但多數(shù)研究均局限于通過(guò)IL-37轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)現(xiàn)，而外源性IL-37作用的相關(guān)報(bào)道所研究的樹突狀細(xì)胞主要是通過(guò)IL-4和GM-CSF體外誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞或人的外周血單個(gè)核細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)的。外源性應(yīng)用IL-37對(duì)人類原代mDC的相關(guān)實(shí)驗(yàn)仍未見(jiàn)報(bào)道。mDC在許多臨床疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，尤其是參與疾病的免疫學(xué)反應(yīng)。我們首先通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)原理分離臍帶血中mDC(Lin-CD123lowHLA-DR+CD11c+細(xì)胞)，分離比例與相關(guān)報(bào)道一致。核因子-κB(NF-κB)是介導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子，包括趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá)[11]。LPS能激活細(xì)胞表面上的Toll樣受體4(TLR4)，進(jìn)而與細(xì)胞內(nèi)的適配器作用激活NF-κB[12]。NF-κB然后可以轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)促炎因子基因的表達(dá)，包括TNF-α和IL-6[13]。許多研究表明，抑制NF-κB能降低炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而保護(hù)小鼠免受致命內(nèi)毒素血癥。我們最近的研究表明，IL-37能抑制小鼠樹突狀細(xì)胞磷酸化NF-κB的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，IL-37能抑制人mDC炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-12的表達(dá)。由于mDC在免疫性疾病及炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，而IL-37抑制mDC炎癥因子的產(chǎn)生能導(dǎo)致免疫反應(yīng)受到抑制，因此推測(cè)，IL-37可能通過(guò)抑制人類原代mDC的NF-κB相關(guān)信號(hào)通路，從而抑制炎癥因子的表達(dá)。我們的前期研究表明，IL-37能夠通過(guò)NF-κB的相關(guān)通路作用于小鼠樹突狀細(xì)胞，從而進(jìn)一步影響T細(xì)胞功能[14]。本研究結(jié)果顯示，LPS能升高mDC中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-12的表達(dá)，而經(jīng)IL-37處理的mDC表達(dá)TNF-α、IL-6、IL-12的水平明顯降低。表明IL-37可能通過(guò)降低NF-κB的激活抑制炎癥因子表達(dá)。已有研究[6]表明，IL-37抗炎活性的產(chǎn)生需要IL-18Rα受體和TIR-8(SIGIRR)。本研究結(jié)果表明，IL-37能夠明顯降低由LPS刺激導(dǎo)致的IL-6和TNF-α的產(chǎn)生。而且本研究中IL-37在較低濃度時(shí)可以降低炎癥因子的表達(dá)，而高濃度時(shí)炎癥因子的抑制效應(yīng)并沒(méi)有明顯增加。我們推測(cè)這可能與mDC表面存在的相應(yīng)受體數(shù)量有關(guān)，也有可能是因?yàn)樵诘蜐舛葧r(shí)IL-37結(jié)合IL-18Rα并募集IL-1R8，而高濃度的IL-37/IL-18Rα復(fù)合物可能會(huì)募集IL-18Rβ，從而激活了相應(yīng)的IL-18信號(hào)通路。

綜上所述，IL-37能夠降低人原代mDC相關(guān)炎癥因子的表達(dá)。這為進(jìn)一步研究IL-37和人原代mDC的生物學(xué)功能提供了新的途徑，為更好地研究IL-37在疾病中的作用機(jī)制奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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2017-05-26)