番茄堿對胃癌細胞增殖和凋亡的影響及機制

宋佳，董翔，韓梅

(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院，烏魯木齊830011)

番茄堿對胃癌細胞增殖和凋亡的影響及機制

宋佳，董翔，韓梅

(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院，烏魯木齊830011)

目的觀察番茄堿對胃癌細胞增殖和凋亡的影響，并探討其分子機制。方法體外培養胃癌BGC-823細胞，番茄堿組分別加入2.5、5、10 μmol/L番茄堿培養24 h；另設對照組，加入培養基培養24 h。采用CCK-8法檢測算細胞增殖抑制率，流式細胞術檢測細胞凋亡抑制率，Western blotting法檢測細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax表達。結果番茄堿組加入2.5、5、10 μmol/L番茄堿培養24 h后，細胞增殖抑制率分別為21.21%±6.43%、42.51%±5.51%、63.71%±4.04%，均高于對照組的12.10%±2.33%；加入10 μmol/L番茄堿后細胞增殖抑制率最高(P均<0.05)。番茄堿組加入2.5、5、10 μmol/L番茄堿培養24 h后，細胞凋亡率分別為13.75%±1.02%、39.23%±1.48%、52.44%±2.02%，均高于對照組的1.52%±0.03%(P均<0.05)；加入10 μmol/L番茄堿后細胞凋亡率最高(P均<0.05)。番茄堿組加入2.5、5、10 μmol/L番茄堿后Bcl-2相對表達量均低于對照組，Bax相對表達量均高于對照組(P均<0.05)。結論番茄堿對胃癌細胞的增殖具有抑制作用，可促進細胞凋亡；其作用機制可能與調節凋亡相關基因Bcl-2、Bax蛋白表達有關。

番茄堿；胃癌；細胞增殖；細胞凋亡；Bcl-2蛋白；Bax蛋白

雖然胃癌化療、手術治療效果顯著，但不良反應明顯，醫療費用昂貴。因此，尋找有效、低毒、價廉的植物用藥治療胃癌意義重大。番茄中富含番茄紅素、β-胡蘿卜素、番茄堿等生物活性物質[2]。研究發現，番茄堿可參與腫瘤細胞增殖、凋亡、轉移及耐藥等多方面的調控，對多種腫瘤細胞和腫瘤動物移植瘤模型均有一定的抑制作用，如結直腸癌[3]、肝癌[3]、前列腺癌[4]、白血病[5]和乳腺癌[6]等，但其對人胃癌細胞作用的研究較少。2015年3月～2016年12月，我們通過體外實驗觀察番茄堿對人胃癌細胞增殖、凋亡的作用，探討番茄堿抗腫瘤的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 胃癌BGC-823細胞株購自武漢博士德公司；番茄堿購自同田生物公司；RPMI1640培養基、胎牛血清購自Hyclone公司；CCK-8試劑盒購自Dojindo公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購自BD公司；蛋白質提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司；Bcl-2、Bax、GAPDH購自CST公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；蛋白質Marker購自Life公司。

1.2 細胞培養與分組處理 將胃癌細胞加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，置于5%CO2、37 ℃培養箱中孵育。待細胞達到90%融合度時，用胰酶消化傳代。取對數生長期的細胞，加入RPMI1640培養液，調整細胞密度為1×105/mL。將細胞接種于96孔板上，37 ℃、5% CO2培養箱中孵育。待細胞完全貼壁后，將細胞分成兩組，番茄堿組分別加入番茄堿2.5、5、10 μmol/L共培養24 h，另設培養基對照組，每組設3個復孔。

1.3 細胞增殖抑制率測算 采用CCK-8法。收集各組細胞，加入90 μL培養基和10 μL CCK-8試劑，置于培養箱中孵育1 h。使用酶標儀于450 nm處檢測各組的吸光度A450值，重復實驗3次。細胞增殖抑制率=[(對照孔A450-實驗孔A450)/(對照孔A450-空白孔A450)]×100%。

1.4 細胞凋亡率測算 采用流式細胞術。收集各組細胞，PBS漂洗3次，按說明書分別加入Annexin V-FITC和PI試劑，30 min內上流式細胞儀(貝克曼MOFIOXDP)進行檢測，利用FlowJo軟件處理數據。

1.5 細胞中Bcl-2、Bax蛋白表達檢測 采用Western blotting法。收集各組細胞，加入含有PMSF的裂解液，4 ℃離心30 min。取上清液，BCA法測定蛋白濃度。參照說明書配置SDS-PAGE膠，常規電泳，轉膜，封閉2 h，分別加入稀釋后的一抗，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗后加入二抗，室溫孵育1 h，ECL發光顯色。以目的條帶與內參GAPDH條帶灰度值的比值表示蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 兩組細胞增殖抑制率比較 番茄堿組以2.5、5、10 μmol/L番茄堿作用于胃癌細胞24 h后，細胞增殖抑制率分別為21.21%±6.43%、42.51%±5.51%、63.71%±4.04%,均高于對照組的12.10%±2.33%(P均<0.05)，且隨濃度增加作用更為顯著。

2.2 兩組細胞凋亡率比較 番茄堿組以2.5、5、10 μmol/L番茄堿作用于胃癌細胞24 h后，細胞凋亡率分別為13.75%±1.02%、39.23%±1.48%、52.44%±2.02%，均高于對照組的1.52%±0.03%(P均<0.05)，且隨濃度增加作用更為顯著。

2.3 兩組細胞Bcl-2、Bax蛋白表達比較 番茄堿組以2.5、5、10 μmol/L番茄堿作用于胃癌細胞24 h后，隨番茄堿濃度升高，Bcl-2表達降低，Bax表達升高，與對照組比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組細胞Bcl-2、Bax蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

番茄堿是番茄根、莖、葉、青果中的天然成分，在番茄各部位含量各有不同。研究顯示，隨著番茄成熟度的增加，其番茄紅素和番茄堿的含量呈負相關的。綠番茄中番茄堿的含量可達500 mg/kg，紅番茄中番茄紅素的含量最高。番茄堿不僅具有廣泛的生物活性，對細菌、病毒、真菌、昆蟲、其他植物、哺乳動物和人都具有顯著的生物學作用；還具有廣泛的藥理學活性，可發揮抗菌[7]、降脂[8]、增強免疫力[9]、抗炎[10]等多種作用。

番茄堿具有低毒、天然、有效的特點。研究發現,番茄堿可參與腫瘤細胞增殖、凋亡、轉移及耐藥等多方面的調控，對多種腫瘤細胞和腫瘤動物移植瘤模型均有一定的抑制作用。體外研究顯示,番茄堿可通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡和抑制腫瘤細胞侵襲轉移等多種途徑，對多種實體瘤發揮抗腫瘤的作用[4,11]。Shieh等[12]研究表明，番茄堿可有效抑制人非小細胞肺癌細胞NCI-H460的轉移侵襲能力，且其抑制效果具有明顯劑量依賴效應。Lee等[4]研究顯示,番茄堿可通過抑制IκBα激酶活性，導致IκBα磷酸化，IκBα發生降解從而影響NF-κB的活性；番茄堿還可抑制TNF-α誘導的NF-κB依賴的促生存蛋白，如Bcl-2、Bcl-xL、c-IAP和XIAP等，發揮促進凋亡的作用。針對肺腺癌的研究[13]顯示，番茄堿可通過抑制PI3K/Akt或NF-κB通路的活性抑制細胞的增殖和遷移能力。本研究結果顯示，番茄堿作用胃癌細胞24 h后，可顯著抑制細胞增殖并促進其凋亡。

細胞過度增殖和凋亡受阻是腫瘤發生的重要原因之一，故抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡可作為治療惡性腫瘤的切入點。目前已知的凋亡信號轉導通路主要有3條：線粒體通路、死亡受體通路及內質網通路。而線粒體通路是最普遍的凋亡機制，是細胞凋亡的核心。Chao等[5]研究顯示，番茄堿可通過上調Bak和Mcl-1s蛋白的表達，改變線粒體膜電位，誘導白血病K562和HL60細胞凋亡，但這一促凋亡作用并不依賴于Caspase級聯反應的激活。Lee等[4]研究證實，番茄堿可降低前列腺癌PC-3細胞中Bcl-2、Bcl-xL、Survivin等細胞增殖、凋亡相關蛋白的表達，從而促進腫瘤細胞凋亡。另一篇針對前列腺癌的研究[12]顯示，番茄堿可有效抑制PC-3細胞增殖，誘導其凋亡，且呈濃度依賴性。本研究主要觀察了番茄堿對胃癌BGC-823細胞線粒體凋亡通路相關蛋白Bcl-2、Bax蛋白表達的影響。Bcl-2作為Bcl-2家族抗凋亡蛋白的重要成員，其過表達與多種惡性腫瘤的發生、發展有關[14]。而Bax可形成同源二聚體，破壞線粒體膜的完整性，發揮促進細胞凋亡的作用。本研究中，與對照組比較，不同濃度番茄堿均可顯著上調Bax表達，下調Bcl-2表達，從而促進胃癌細胞發生凋亡,且隨其濃度的增高，促凋亡作用逐漸增強。由此推測，番茄堿可能通過線粒體凋亡途徑，調節凋亡相關蛋白的表達，進而發揮誘導胃癌細胞凋亡的作用。

綜上所述，番茄堿能夠在體外抑制胃癌BGC-823細胞增殖并誘導其凋亡，這一過程可能通過Bcl-2/Bax相關的信號通路介導。其確切機制及體內實驗是否有類似結果，有待進一步研究。

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2017-05-11)