非融合綠色熒光蛋白標記EV71型人腸道病毒的構建

耿磊，竇燁，王清路

(齊魯醫藥學院，山東淄博255213)

非融合綠色熒光蛋白標記EV71型人腸道病毒的構建

耿磊，竇燁，王清路

(齊魯醫藥學院，山東淄博255213)

目的構建非融合綠色熒光蛋白(EGFP)標記的腸道病毒71型(EV71)，為EV71抗病毒機制研究及抗病毒藥物的篩選提供方法。方法取野生型病毒EV71，在EV71基因組的3D蛋白編碼區后添加HBV的link序列，將EGFP基因連入link與EV71型病毒3′非翻譯區之間，構建EGFP標記的EV71病毒基因組，并轉染橫紋肌瘤RD細胞以獲得EV71-link-EGFP重組病毒。采用PCR方法鑒定重組病毒中link、EGFP位置。感染RD細胞后24、48、72、96、120、144和168 h時收獲病毒，采用組織半數感染量法測定病毒滴度，繪制病毒生長曲線，比較重組病毒與野生型病毒的生長動力學。RT-PCR測定EGFP轉錄表達。將重組病毒感染RD細胞后72 h裂解，采用Western blotting法檢測RD細胞中GFP、P1蛋白的表達情況。重組病毒感染RD細胞后，經過13輪傳代，Western blotting法檢測EGFP基因穩定性。結果RD細胞內表達較強的GFP熒光，病毒感染細胞后病毒的mRNA正常表達，重組病毒中link序列、EGFP基因鏈接位置正常，證實EV71-link-EGFP重組病毒拯救成功。重組病毒滴度的曲線峰值與野生型病毒滴度的峰值相同。重組病毒中EGFP的表達在48 h時最高。重組病毒中GFP和P1蛋白表達正常穩定。經過13輪傳代，第13代重組病毒表達的GFP蛋白與第1代無明顯差別。結論通過添加link序列成功構建了非融合表達的EV71-link-EGFP重組病毒，可在RD細胞中良好生長并高效表達EGFP，且具有穩定的遺傳性。

人腸道病毒；腸道病毒71型；綠色熒光蛋白；熒光標記；基因重組

腸道病毒屬于小RNA病毒科，分為腸道病毒A、B、C、D共4種類型。腸道病毒71型(EV71)屬于HEV-A型，其感染后主要引起手足口病，還能引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎和麻痹型脊髓灰質炎等多種與神經系統相關的疾病。自1957年首次被報道以來，EV71已引發全球范圍內的10多次爆發與流行[1,2]，主要通過糞口傳播，還可通過飛沫傳播，其他則以隱性感染為主[3]。目前，臨床上尚缺乏特異高效的EV71抗病毒藥物，只能以對癥支持治療為主[4]。因此，構建EV71重組病毒對于研究EV71的致病機制及研制抗病毒藥物具有重要意義。利用熒光蛋白對病毒結構蛋白進行標記或使其伴隨病毒結構蛋白同時表達，是目前構建熒光病毒的一種常用方法，有助于對病毒侵染細胞的過程和繁殖狀況進行觀察。研究發現，將增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因連入EV71病毒基因組5′端后，可實現EGFP與病毒蛋白的融合表達，但添加的EGFP基因在表達成綠色熒光蛋白(GFP)后，與病毒蛋白呈融合狀態，可能會影響病毒蛋白的成熟及組裝效率，進而影響病毒的繁殖[5]。2015年1月～2017年3月，我們在EV71病毒基因組3D蛋白編碼區后添加HBV的非編碼link序列，構建EGFP標記的EV71重組病毒，以既實現EGFP與病毒蛋白的非融合表達，又促進病毒蛋白的穩定表達，為新型抗病毒藥物的篩選提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 橫紋肌瘤細胞RD細胞株由本實驗室保存培養；大腸桿菌DH5α為本實驗室保存；pEGFPN1-EV71-GFP載體由本實驗室構建。DNA Marker、rTaq DNA聚合酶及限制性內切酶購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA回收試劑盒、質粒抽提試劑盒(B型質粒小量提取試劑盒)、LB培養基購自上海生工生物工程有限公司；EV71病毒P1蛋白和EGFP蛋白單抗購自Abcam公司；NC膜其他試劑等均國產；青霉素、鏈霉素、卡那霉素購自北京索萊寶公司；EZfusion同源重組酶購自上海捷瑞生物有限公司。PCR引物合成和DNA序列測定由寶生物工程(大連)有限公司完成。

1.2 攜帶EGFP基因的EV71病毒基因組的構建 根據野生型病毒EV71型(GenBank: JF738002.1)全長序列分析，選擇在病毒基因組的第7 218位堿基后插入來源于HBV兩編碼基因之間的link序列，link序列之后插入EGFP基因序列(自帶終止密碼子TTA)，最后連入EV71型病毒3′端非翻譯區，即第7 218位以后的序列，見圖1。在全基因組序列的5′端添加SacⅠ酶切位點，3′端添加NotⅠ酶切位點。根據EV71-7 218 bp序列、link序列、EGFP序列以及7 218 bp以后序列，分別設計引物，通過PCR方法獲得各個片段，相鄰片段間有20 bp的相同堿基。將PCR產物與用SacⅠ和NotⅠ線性化的pEGFP-N1載體等比例混合，用EZfusion同源重組酶處理后轉化大腸桿菌，即獲得重組EV71型病毒基因組。

注：UTR為非翻譯區；link為 HBV兩編碼基因之間的DNA序列。

圖1EV71-link-EGFP重組病毒基因組結構

1.3 重組病毒的拯救 用大提試劑盒提取pEGFP-N1-EV71-link-EGFP質粒，按照Lipofectamine2000轉染試劑說明書，將大提的質粒轉染至生長為70%的RD細胞培養板中(6孔板)，轉染劑量為2.5 μg，6 h后換為含有質量分數為3%胎牛血清的DMEM維持液，并將轉染的6孔板置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養72 h，使質粒能夠在細胞內更有效地轉錄病毒基因組RNA。72 h后換為2%的DMEM維持液，并將細胞轉移到33 ℃、5%CO2孵箱中培養72 h。為了獲得更多的病毒，在33 ℃、5%CO2培養3 d后的細胞，以1∶3的比例傳代到細胞培養瓶中，37 ℃、5%CO2培養48 h。待細胞融合達到80%左右時，換為2%的DMEM維持液，轉入33 ℃、5%CO2孵箱中進行培養，3 d后收取細胞和上清，經37 ℃與-80 ℃反復凍融3次，混合后于3 000 r/min離心5 min，0.45 μm的濾膜過濾，將收獲的病毒命名為EV71-link-EGFP。

1.4 EV71-link-EGFP重組病毒的鑒定

1.4.1 重組病毒mRNA表達檢測 將拯救的重組病毒EV71-link-EGFP及其野生型病毒分別接種于生長至70%的RD細胞中，2 h后用PBS洗1遍，換為DMEM，在5%CO2、37 ℃環境中繼續培養。72 h后棄掉培養液，用PBS清洗細胞2遍，然后用冷無水乙醇固定細胞。30 min后加入抗P1蛋白的血清，在室溫下作用2 h后用PBS洗滌細胞3次，并加入1∶200稀釋的FITC標記的羊抗鼠IgG，于室溫中避光作用1 h，用PBS洗滌細胞3次，5 min/次，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.2 重組病毒link、EGFP序列檢測 采用TRIzol法。提取細胞總RNA，利用TaKaRa反轉錄試劑盒獲得cDNA，以cDNA為模板，用引物EV71F(5′-GCAATTAGATCCGTCCCAATAGG-3′)和linkR(5′-TTACCCTCGGATCCAACAAGG-3′)鑒定link序列的鏈接，用引物EV71F與GFPR(5′-TGGCATCGCCCTCGCCCTCG-3′)鑒定GFP基因的鏈接，以證實EGFP基因鏈接位置是否正常。

1.5 EV71-link-EGFP重組病毒生長動力學測定 將重組病毒和野生型病毒分別按MOI 0.01/孔的感染量接種于生長至單層的RD細胞中，并在感染后24、48、72、96、120、144、168 h時收獲病毒。將不同時間點收獲的病毒分別用采用組織半數感染量(TCID50)法測定病毒滴度，繪制病毒生長曲線，比較重組病毒與野生型病毒的生長動力學。

1.6 EV71-link-EGFP重組病毒報告基因表達測定 將重組病毒按MOI 0.01/孔劑量感染24孔板中的RD細胞，分別于感染后24、48、72、96、120、144、168 h時，應用RT-PCR方法測定EGFP轉錄表達，以評價重組病毒表達EGFP基因的能力。

1.7 EV71-link-EGFP重組病毒中GFP、P1蛋白表達檢測 將重組病毒及其野生型病毒的RD細胞在72 h后裂解，采用Western blotting法檢測第1代、第3代RD細胞中GFP、P1蛋白的表達情況，以進一步驗證重組病毒表達EGFP基因的能力。

1.8 EV71-link-EGFP重組病毒遺傳穩定性分析 將重組病毒(定義為P0)以MOI=0.01劑量感染RD細胞，感染96 h時收獲病毒(定義為N1)，之后將300 μL N1代病毒液加入到新鮮RD細胞中培養(定義為N2)。經過13輪類似的傳代，TCID50方法測定病毒滴度，以評價插入的EGFP基因在重組病毒基因組中的遺傳穩定性。

2 結果

2.1 EV71-link-EGFP重組病毒鑒定結果 熒光顯微鏡示，RD細胞內表達較強的FITC標記熒光，病毒感染細胞后，病毒的mRNA正常表達，證實EV71-link-EGFP重組病毒拯救成功。見圖2。經引物EV71F和linkR鑒定，link序列鏈接正確。經引物EV71F與GFPR鑒定GFP基因鏈接，證實EGFP基因鏈接位置正常。

2.2 RD細胞中重組病毒生長動力學結果 RD細胞中EV71-link-EGFP病毒滴度的生長曲線峰值與野生型病毒滴度的峰值相同。見圖3。

2.3 RD細胞中重組病毒報告基因表達動力學測定結果 RD細胞中EV71-link-EGFP重組病毒EGFP的表達在48 h時最高。見圖4。

2.4 RD細胞中GFP、P1蛋白表達結果 Western blotting實驗證實，第1代、第3代RD細胞中GFP和P1蛋白表達正常穩定。見圖5。

注：M為Marker；1為GFP；2為link。

圖2RD細胞內EV71mRNA表達情況

圖3 RD細胞中EV71-link-EGFP重組病毒生長曲線

圖4 RD細胞中EV71-link-EGFP重組病毒

注：1為第1代病毒，2為第3代病毒。

圖5EV71-link-EGFP重組病毒中GFP、P1蛋白表達結果(Westernblotting法)

2.5 重組病毒遺傳穩定性結果 EV71-link-EGFP重組病毒在RD細胞上連續傳代的過程中，第13代病毒表達的GFP與第1代無明顯差別，并未發生病毒傳代丟失EGFP基因等現象。見圖6。

注：WT為野生型病毒；N1為第1代病毒蛋白；N13為第13代病毒蛋白。

圖6EV71-link-EGFP重組病毒遺傳穩定性結果

3 討論

EV71病毒是誘發嬰幼兒手足口病的主要病毒之一。人類是EV71惟一已知的自然宿主，10歲以下兒童為主要易感人群，主要通過糞口傳播，還可通過飛沫傳播，其他則以隱性感染為主[3,6]。EV71的基因組為約7.4 kb的單股正鏈RNA，僅含一個開放閱讀框(ORF)，編碼含有2 193個氨基酸的多聚蛋白[7,8]。在EV71基因組的5′端和3′端，分別有約為745 nt的5′非編碼區(UTR)和約為83 nt的3′非編碼區[5,9]。目前EV71抗病毒藥物的開發重點集中在阻止病毒與細胞膜吸附、侵入和脫殼，以及失活病毒的RNA復制酶RdRp(3D)[10，11]。構建熒光病毒有利于通過熒光定位直觀觀察病毒是否能夠侵入細胞，進而用于藥物抑制病毒侵染細胞具體環節的研究，從而研究藥物是抑制病毒侵入還是抑制病毒繁殖。

利用各種熒光蛋白或其他物質對病毒結構蛋白進行標記，或者伴隨病毒結構蛋白同時表達，可完成對病毒侵染細胞過程和繁殖狀況的觀察，也可為抗病毒藥物篩選和作用機制研究提供幫助[12，13]。近年來，GFP已經成功地用于標記HBV、艾滋病病毒、腺相關病毒及皰疹病毒等多種病毒[14，15]。EGFP比GFP具有更強的熒光蛋白表達量，可更容易地檢測病毒的侵染和繁殖。重組病毒基因組中的EGFP基因是熒光報告基因，其不僅可以直觀地提供病毒侵入細胞的效率，還可以檢測病毒在細胞內重新組裝生成的情況。江軍[16]制備了家蠶濃核病毒結構蛋白VP4與EGFP融合表達的熒光病毒樣顆粒，為家蠶病毒的防治奠定了基礎。彭瑩等[17]構建了表達EGFP的巨細胞病毒Towne株，為研究巨細胞病毒致病機制和抗病毒藥物篩選的新型工具提供了載體。朱守海等[5]將EGFP基因連入EV71病毒基因組5′端，實現了EGFP與病毒蛋白的融合表達，最后再利用2A酶活性去除GFP，使EV71病毒子代顆粒順利組裝。然而該設計中添加的EGFP基因在表達成GFP蛋白后，與病毒蛋白呈融合狀態，可能會影響病毒蛋白的成熟及組裝效率，進而影響病毒的繁殖。研究發現，通過添加HBV序列中link序列的方法，可避免EGFP蛋白對病毒蛋白表達的影響。

本研究利用生物信息學以及PCR、DNA片段連接等分子克隆技術構建熒光標記病毒，在EV71型病毒基因組的3D蛋白編碼區后面添加HBV的link序列，而后將EGFP基因連入link與EV71型病毒3′非翻譯區之間，從而構成熒光蛋白標記的病毒基因組。本研究發現，經引物EV71F和linkR鑒定，link序列鏈接正確；經引物EV71F與GFPR鑒定GFP基因鏈接，證實EGFP基因鏈接位置正常，表明EGFP序列連入了重組病毒的基因組預期位置；熒光顯微鏡示，RD細胞內表達較強的FITC標記熒光，病毒感染細胞后病毒的mRNA正常表達，證實重組病毒拯救成功；IFA示，EV71-link-EGFP病毒滴度的生長曲線峰值與野生型病毒滴度的峰值相同，表明病毒生長曲線與野生病毒株相似，不影響病毒翻譯后的蛋白加工修飾；重組病毒EGFP的表達在48 h時最高，重組病毒中GFP、P1蛋白表達正常穩定，且在表達量比例上無明顯差別，表明該病毒能夠高效表達EGFP基因，拯救的重組病毒產生的EGFP也不影響子代病毒顆粒組裝，表明插入的EGFP基因在連續傳代過程中較為穩定。

由于EGFP基因對EV71病毒屬于外源基因，對病毒自身繁殖來說并不是必須的，因此可能在病毒的傳代過程中該基因被丟失。為了觀察EGFP基因的遺傳穩定性，我們將EV71-link-EGFP重組病毒在RD細胞上進行13次傳代，以檢查插入的EGFP基因在四株重組病毒基因組中的遺傳穩定性。本研究結果顯示，重組病毒在RD細胞上連續傳代的過程中，第13代病毒表達的GFP與第1代無明顯差別，并未發生病毒傳代丟失EGFP基因等現象，表明重組病毒EV71-link-EGFP具有穩定的遺傳性。

綜上所述，通過生物信息學以及PCR、DNA片段連接等分子克隆技術成功構建了EV71-link-EGFP重組病毒，可在RD細胞中良好生長并高效表達EGFP，且能穩定遺傳EGFP基因而不丟失，為借助酶標儀等相關儀器構建抗病毒藥物的高通量篩選平臺或研究該病毒的感染機制提供了高效的載體。

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ConstructionofEV71genomelabeledbynon-fusionenhancedgreenfluorescentprotein

GENG Lei, DOU Ye, WANG Qinglu

(Qilu Medical University, Zibo 255213, China)

ObjectiveTo construct the Enterovirus 71 (EV71) labeled by non-fusion enhanced green fluorescent protein (EGFP) so as to provide a method for studying the anti-viral mechanism of EV71 and screening of antiviral drugs.MethodsThe EV71 genome labeled by EGFP was constructed by connecting non-fusion link-EGFP sequence in the back of 3D sequence and front of 3'-UTR, and then new EV71 virus was obtained by transferring EV71-link-EGFP plasmid into RD cell line. The location of link and EGFP sequence were identified by PCR. Virus titer was estimated with TCID50 methods at the 24, 48, 72, 96, 120, 144, and 168 h after RD cells were infected, respectively. The mRNA level was analyzed by RT-PCR. The recombinant virus was used to infect the RD cells and RD cells lysed after 72 h. The GFP and P1 protein expression was detected by Western blotting. After the recombinant virus infected RD cells, and after 13 rounds of passage, the EGFP gene stability was determined by Western blotting.ResultsEV71-link-EGFP recombinant virus was obtained via analyzing mRNA expression level, observing GFP fluorescence and locating link and EGFP site. The curve peak in recombinant virus was the same as the wild type virus. The GFP fluorescence value in recombinant virus was the highest at 48 h. GFP and P1 proteins were stably expressed in recombinant virus. GFP protein level in 13th generation recombinant virus had no significant difference as compared with that of the first generation.ConclusionEV71-Link-EGFP recombinant virus is constructed successfully via adding link sequence between 3D and EGFP sequence, which can grow well, effectively express EGFP gene in RD cells and has stable heredity.

human enterovirus; Enterovirus 71 type; green fluorescent protein; fluorescence labeling; genetic recombination

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.42.006

Q784；R373.2

A

1002-266X(2017)42-0020-05

山東省高校中醫藥抗病毒協同創新中心基金資助項目(XTCX2014B01-07)。

耿磊(1974-)，男，碩士，副教授，主要研究方向為抗病毒藥物篩選。E-mail: 778175260@qq.com

王清路(1976-)，男，博士，教授，主要研究方向為中醫藥抗病毒研究。E-mail: wql_zcq@126.com

2017-06-02)