薯蕷皂苷對(duì)哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)的影響

李先茜，吳寧，余榮環(huán)，管超，徐婷，吳嘉熙

(上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院，上海200031)

薯蕷皂苷對(duì)哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)的影響

李先茜，吳寧，余榮環(huán)，管超，徐婷，吳嘉熙

(上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院，上海200031)

目的觀察薯蕷皂苷對(duì)哮喘模型小鼠氣道上皮細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體GRα、GRβ表達(dá)的影響，探討其對(duì)哮喘的抗炎作用機(jī)制。方法取哮喘模型小鼠氣道上皮細(xì)胞，將其分為哮喘對(duì)照組(加入不含藥物的培養(yǎng)基)、哮喘治療組(加入含薯蕷皂苷的培養(yǎng)基)、哮喘治療拮抗組(加入含薯蕷皂苷和GR拮抗劑RU486的培養(yǎng)基)。以正常小鼠氣道上皮細(xì)胞為空白對(duì)照組。采用ELISA方法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-1、IL-6、TNF-α水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中GRα、GRβ、HSP90 mRNA表達(dá)，Western blotting法檢測(cè)各組GRα、GRβ、HSP90蛋白表達(dá)。結(jié)果哮喘對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-1、IL-6、TNF-α水平高于空白對(duì)照組，哮喘治療組IL-1、IL-6、TNF-α水平低于哮喘對(duì)照組，哮喘治療拮抗組IL-1、IL-6、TNF-α水平高于哮喘治療組(P均<0.05)。哮喘治療組GRα 、GRβ、HSP90 mRNA和蛋白表達(dá)低于空白對(duì)照組(P均<0.05)；哮喘治療組GRα蛋白表達(dá)高于哮喘對(duì)照組(P<0.05)；GRβ、HSP90 mRNA和蛋白表達(dá)低于哮喘對(duì)照組(P均<0.05)。哮喘治療拮抗組中GRα、GRβ、HSP90 mRNA和蛋白表達(dá)與模型對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論薯蕷皂苷通過(guò)調(diào)節(jié)氣道上皮細(xì)胞中GRα、GRβ和HSP90的表達(dá)量來(lái)發(fā)揮其在哮喘小鼠中的抗炎作用。

哮喘；薯蕷皂苷；氣道上皮細(xì)胞；糖皮質(zhì)激素受體；熱休克蛋白90；小鼠

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)是由多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的慢性氣道炎癥性疾病。氣道炎癥導(dǎo)致氣道損傷，平滑肌收縮，使易感者對(duì)各種激發(fā)因子具有氣道高反應(yīng)性，進(jìn)而引起組織水腫，氣道壁增生肥厚、結(jié)構(gòu)異常，并引起氣道狹窄，造成不可逆性氣道阻塞。氣道上皮損傷是引起氣道高反應(yīng)性的重要機(jī)制之一。糖皮質(zhì)激素對(duì)哮喘的抗炎效應(yīng)主要通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體(GR)來(lái)實(shí)現(xiàn)[1]。GR包括GRα和GRβ，糖皮質(zhì)激素主要通過(guò)結(jié)合GRα發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。GRβ能與DNA結(jié)合，不能被糖皮質(zhì)激素活化，并通過(guò)干擾GRα與DNA結(jié)合對(duì)GRα有拮抗作用，對(duì)糖皮質(zhì)激素的生理功能具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，且可能與激素的耐藥性有關(guān)[2～4]。GR的形成、激活及功能發(fā)揮與熱休克蛋白90(HSP90)關(guān)系密切。HSP90可與GRα組成復(fù)合體，以激活前狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并抑制其進(jìn)入細(xì)胞核[5～7]。HSP90與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合后可以抑制其發(fā)揮作用。然而糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期使用易造成激素依賴[8]。中醫(yī)藥在增加激素敏感性、減少激素用量及降低不良反應(yīng)等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。中藥穿山龍具有活血祛風(fēng)、化痰平喘的作用，臨床用于治療哮喘已取得良好效果[9]。現(xiàn)代藥理研究顯示，穿山龍具有抗氧化、抗炎作用，其主要成分薯蕷皂苷的結(jié)構(gòu)與激素相似[10]，可能具有與糖皮質(zhì)激素競(jìng)爭(zhēng)GR的能力，但目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)研究。我們于2013～2016年觀察了薯蕷皂苷對(duì)氣道上皮細(xì)胞GR活性的影響，探討其抗炎作用機(jī)制，為薯蕷皂苷治療支氣管哮喘提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)用氣道上皮細(xì)胞來(lái)源于正常清潔型BALB/c小鼠和同類(lèi)小鼠的哮喘模型(由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所提供)。薯蕷皂苷(南京春秋生物工程有限公司)，胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen公司)；兔抗鼠GRa、GRb、HSP90、β-actin抗體(SANTA公司)。IL-6、TNF-α、IL-1β的ELISA檢測(cè)試劑盒由北京百靈克生物科技有限責(zé)任公司提供。

1.2 細(xì)胞分組與處理 取正常小鼠氣道上皮細(xì)胞和哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞，分別加入含10%小牛血清的RPMI1640高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%并貼壁后，加入0.25%胰酶消化，倒置顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞間隙增大、胞質(zhì)回縮時(shí)消化終止，然后分瓶再培養(yǎng)；待進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，棄去原培養(yǎng)液，用PBS沖洗后用于實(shí)驗(yàn)。將哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞分為哮喘對(duì)照組、哮喘治療組、哮喘治療拮抗組，哮喘對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，哮喘治療組加入含薯蕷皂苷10 μmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h，哮喘治療拮抗組加入含薯蕷皂苷注射液10 μmol/L和GR拮抗劑RU486 100 nmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h。以正常小鼠氣道上皮細(xì)胞作為空白對(duì)照組。

1.3 細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β水平檢測(cè) 采用ELISA方法。收集細(xì)胞上清液，使用ELSIA試劑盒檢測(cè)IL-6、TNF-α、IL-1β水平。

1.4 細(xì)胞中GRα、GRβ、HSP90 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。按Triozol說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。GRa、GRb、HSP90、GAPDH的引物由吉瑪基因公司合成。GRa引物：上游5′-ACACAGGCTTCAGGTATCTT-3′，下游5′-ACTGCTTCTGTTGCCAAG-3′；GRb引物：上游5′-ACACAGGCTTCAGGTATCTT-3′，下游5′-CGCCAAGATTGTTGGGATGA-3′；HSP90引物：上游5′-GTCTGGGTATCGGAAAGCAAG-3′，下游5′-GTGAGGGTTGGGGATGATGTC-3′；內(nèi)參GAPDH引物：上游5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。反應(yīng)體系：MasterMix(2×)10 μL，上、下游引物各0.6 μL(10 μmol/L)，cDNA 4 μL，H2O 4.8 μL，總體積20 μL。循環(huán)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，記錄相關(guān)Ct值。利用β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算GRα、GRβ、HSP90 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞中GRα、GRβ、HSP90蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。向細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，離心取上清，蛋白定量后分別取50 μg蛋白加入上樣緩沖液，95 ℃變性10 min。12%聚丙烯酰胺-SDS凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉，依次加入一抗、二抗，室溫孵育2 h。TBST緩沖液洗滌，加入化學(xué)發(fā)光試劑，壓片，顯影，定影，照相。使用抗兔多克隆抗體檢測(cè)GRα、GRβ、HSP90蛋白。以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算GRα、GRβ、HSP90蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞上清液中IL-1、IL-6、TNF-α水平比較 見(jiàn)表1。哮喘對(duì)照組細(xì)胞上清液中IL-1、IL-6、TNF-α水平高于空白對(duì)照組(P均<0.05)，哮喘治療組IL-1、IL-6、TNF-α水平低于哮喘對(duì)照組(P均<0.05)，哮喘治療拮抗組IL-1、IL-6、TNF-α水平高于哮喘治療組(P均<0.05)。

表1 各組細(xì)胞上清液中IL-1、IL-6、TNF-α水平比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與哮喘對(duì)照組比較，#P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞中GRα、GRβ、HSP90 mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表2。哮喘對(duì)照組GRα mRNA表達(dá)低于正常對(duì)照組，GRβ、HSP90 mRNA表達(dá)高于正常對(duì)照組(P均<0.05)；哮喘治療組GRα mRNA表達(dá)高于哮喘對(duì)照組，GRβ、HSP90 mRNA表達(dá)低于哮喘對(duì)照組(P均<0.05)；哮喘治療拮抗組GRα、GRβ、HSP90 mRNA表達(dá)與哮喘對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。

表2 各組細(xì)胞中GRα、GRβ、HSP90 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與哮喘對(duì)照組比較，#P<0.05。

2.3 各組細(xì)胞中GRα、GRβ、HSP90蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表3。哮喘對(duì)照組GRα蛋白表達(dá)低于空白對(duì)照組，GRβ、HSP90蛋白表達(dá)高于空白對(duì)照組(P均<0.05)。哮喘治療組GRα蛋白表達(dá)高于哮喘對(duì)照組，GRβ、HSP90蛋白表達(dá)低于哮喘對(duì)照組(P均<0.05)。哮喘治療拮抗組GRα、GRβ、HSP90蛋白表達(dá)與哮喘對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。

表3 各組細(xì)胞中GRα、GRβ、HSP90蛋白水平比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與哮喘對(duì)照組比較，#P<0.05。

3 討論

糖皮質(zhì)激素是截至目前控制哮喘最為有效的藥物。它需要與GR特異性結(jié)合才能發(fā)揮抑制氣道炎癥作用。GR在肺內(nèi)廣泛存在[11]，糖皮質(zhì)激素主要通過(guò)結(jié)合GRα發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。糖皮質(zhì)激素以擴(kuò)散作用穿過(guò)細(xì)胞膜，與胞質(zhì)內(nèi)未激活的GRα相結(jié)合，使得HSP90與GRα分離，形成GRα-糖皮質(zhì)激素復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核。GRα-糖皮質(zhì)激素復(fù)合體的作用機(jī)制包括：直接與激素應(yīng)答基因啟動(dòng)區(qū)的糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件結(jié)合，激活抗炎蛋白編碼的基因，誘導(dǎo)抗炎蛋白合成；與其他轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB共同競(jìng)爭(zhēng)環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生炎癥抑制作用；增加鋅指蛋白36的表達(dá)，抑制IL-1、IL-6、TNF-α等與哮喘有關(guān)的細(xì)胞因子水平[12，13]。然而，布地奈德等糖皮質(zhì)激素藥物長(zhǎng)期使用可引起諸多不良反應(yīng)，反饋性減少促皮質(zhì)激素和糖皮質(zhì)激素的合成及釋放，進(jìn)一步加重GR數(shù)量減少，增加機(jī)體對(duì)激素的依賴性。中醫(yī)認(rèn)為，伏痰是哮喘發(fā)病的主要的內(nèi)在因素，痰氣瘀阻、肺失宣降為哮證的基本病機(jī)，痰、氣、瘀為主要病理因素，三者膠結(jié)為患，既是哮喘發(fā)病過(guò)程中的病理產(chǎn)物，又是哮喘反復(fù)發(fā)作、病情發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。其治療應(yīng)以化痰祛瘀、降氣平喘為基本大法，使氣血調(diào)暢、肺絡(luò)宣通。中藥穿山龍是薯蕷科薯蕷屬植物穿龍薯蕷的根莖，具有活血舒筋、祛風(fēng)除濕、化痰平喘之功。薯蕷皂苷為穿山龍的藥物主要單體成分，具有抗炎、抗過(guò)敏、鎮(zhèn)咳、平喘等多種藥理作用[14，15]。臨床將薯蕷皂苷用于治療支氣管哮喘已取得較好效果[16]。本研究顯示，哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-1、IL-6、TNF-α水平高于正常，應(yīng)用薯蕷皂苷作用后，IL-1、IL-6、TNF-α降低；使用GR拮抗劑RU486可以抵消薯蕷皂苷對(duì)IL-1、IL-6、TNF-α水平的影響。薯蕷皂苷與甾體激素類(lèi)藥物結(jié)構(gòu)相近，是合成甾體激素的主要原料之一，因此可能具有與之競(jìng)爭(zhēng)糖皮質(zhì)激素受體的活性部位的能力，從而阻礙相關(guān)臟器對(duì)皮質(zhì)激素的還原代謝。

GRα能與糖皮質(zhì)激素結(jié)合發(fā)揮作用；GRβ能與DNA結(jié)合，不能被糖皮質(zhì)激素活化，對(duì)GRα具有拮抗作用，對(duì)糖皮質(zhì)激素的生理功能具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，且可能與激素的耐藥性有關(guān)。故GRα和GRβ在哮喘發(fā)病時(shí)會(huì)升高，在薯蕷皂苷藥物治療時(shí)與GRα和GRβ發(fā)生特異性結(jié)合才能發(fā)揮抑制氣道炎癥作用。GRα的形成和功能的發(fā)揮又與HSP90的作用密切相關(guān)。在游離狀態(tài)下GR以復(fù)合物的形式存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，該受體復(fù)合物以HSP90的作用最為重要，它可以抑制未結(jié)合激素的GRα進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。當(dāng)激素以擴(kuò)散作用穿過(guò)細(xì)胞膜并與胞質(zhì)內(nèi)未激活的GRα相結(jié)合后，通過(guò)磷酸化作用引起構(gòu)型改變，HSP90與GRα分離，使得GRα-糖皮質(zhì)激素復(fù)合體活化，并得以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的GRα-糖皮質(zhì)激素復(fù)合體可以發(fā)揮其生理功能。糖皮質(zhì)激素最終抑制了IL-1、IL-6、TNF-α等與哮喘有關(guān)的細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄。因此，GR在哮喘的炎癥反應(yīng)及治療過(guò)程中具有重要作用。

本研究顯示，哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞中GRα、GRβ mRNA和蛋白表達(dá)水平低于正常氣道上皮細(xì)胞，而HSP90 mRNA和蛋白表達(dá)高于正常氣道上皮細(xì)胞；應(yīng)用薯蕷皂苷后，細(xì)胞中GRα、GRβ mRNA和蛋白表達(dá)升高，HSP90 mRNA和蛋白表達(dá)降低；使用GR拮抗劑RU486可以抵消薯蕷皂苷對(duì)GRα、GRβ、HSP90 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。

綜上所述，薯蕷皂苷對(duì)支氣管哮喘有一定的抗炎作用。薯蕷皂苷通過(guò)調(diào)節(jié)氣道上皮細(xì)胞中GRα、GRβ和HSP90的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其在哮喘模型小鼠中的抗炎作用。

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Effectofdioscinonglucocorticoidreceptorofairwayepithelialcellsinmicewithasthma

LI Xianqian, WU Ning, YU Ronghuan, GUAN Chao, XU Ting, WU Jiaxi

(Shanghai Xuhui Central Hospital, Shanghai 200031, China)

ObjectiveTo observe the effects of dioscin on the glucocorticoid receptor GRα and GRβ of airway epithelial cells in mouse models with asthma, and to investigate its anti-inflammatory effect on asthma.MethodsNormal mouse airway epithelial cells were used as the blank control group, and the airway epithelial cells from asthmatic mouse models were divided into 3 groups as following: asthmatic non-treatment group (cells cultured in a medium containing no drug), asthmatic treatment group (cells cultured in a medium containing dioscin), and asthmatic antagonistic group (cells cultured in medium containing dioscin and GR antagonists, RU486). The levels of IL-1, IL-6 and TNF-α in the conditional media were measured by using ELISA. The mRNA and protein levels of GRα, GRβ, and HSP90 in the cells were detected by using real-time quantitative PCR and Western blotting, respectively.ResultsThe levels of IL-1, IL-6, and TNF-α were significantly higher in the asthmatic non-treatment group than in the asthmatic treatment group and the blank control group, and the levels of IL-1, IL-6, and TNF-α were higher in the asthmatic antagonistic group than in the asthmatic treatment group (allP<0.05). The expression of GRα, GRβ, and HSP90 at protein and mRNA levels was significantly lower in the asthmatic treatment group than in the blank control group (allP<0.05). The expression of GRα was higher, while the expression of GRβ and HSP90 at protein and mRNA levels was lower in the asthmatic treatment group than in the asthmatic non-treatment group (allP<0.05). The expression of GRα, GRβ, and HSP90 at protein and mRNA levels of the asthmatic antagonistic group had no statistic difference as compared with that of the asthmatic non-treatment group.ConclusionDioscin exerts its anti-inflammatory effects in asthmatic mice by regulating the expression of GRα, GRβ, and HSP90 in airway epithelial cells.

asthma; dioscin; airway epithelial cells; glucocorticoid receptor; heat shock protein 90; mice

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.42.005

R562.2

A

1002-266X(2017)42-0016-04

上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研項(xiàng)目(20134206)。

李先茜(1973-)，女，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)及免疫學(xué)。E-mail: xeexee@126.com

2017-01-15)