過表達和敲除SLUG基因卵巢癌SKOV3細胞穩(wěn)定株的建立

雷靜，趙然，高茹，辛靈彪，劉欣

(天津醫(yī)科大學，天津300070)

·論著·

過表達和敲除SLUG基因卵巢癌SKOV3細胞穩(wěn)定株的建立

雷靜，趙然，高茹，辛靈彪，劉欣

(天津醫(yī)科大學，天津300070)

目的利用慢病毒載體和改良的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)分別構建過表達和敲除SLUG基因的卵巢癌SKOV3細胞穩(wěn)定株。方法①以質粒pCMV-Myc-SLUG為模板擴增出HA-SLUG基因，將其連接到慢病毒表達質粒pLVX-IRES-Hyg中。將此重組表達載體pLVX-HA-SLUG通過病毒感染法感染SKOV3細胞(實驗組)，以相同條件制備pLVX-IRES-Hyg空載體的慢病毒作為陰性對照，Western blotting法檢測兩組SLUG蛋白表達。②將一對能特異結合SLUG基因的sgRNA分別連接到載體PX462中，獲得的一對重組質粒通過脂質體法共轉染SKOV3細胞，篩選穩(wěn)定株，挑取單克隆細胞(實驗組)，用Western blotting法檢測SLUG蛋白表達，另設空白對照組，不加任何處理。結果①對挑取的單克隆菌液進行PCR擴增，陽性者提取質粒進行PCR和雙酶切，兩者驗證正確后進行DNA測序鑒定，結果證實重組質粒構建成功。陰性對照組與實驗組SLUG蛋白相對表達量分別為0.92±0.02和3.14±0.04，實驗組SLUG蛋白表達高于陰性對照組(P<0.01)。②挑取4個單克隆細胞進行測定，SLUG蛋白的相對表達量分別為0.07±0.01、0.06±0.01、0.21±0.02、0.20±0.01，空白對照組為0.56±0.03。實驗組SLUG蛋白相對表達量低于空白對照組(P均<0.01)。結論過表達和穩(wěn)定敲除SLUG基因的SKOV3細胞株構建成功，為進一步探討SLUG在卵巢癌中的作用提供了細胞模型。

SLUG基因；慢病毒載體；SKOV3細胞；卵巢癌；細胞模型

人類SLUG蛋白又稱為Snai2，是Snail家族成員之一，最初在雞胚的神經(jīng)嵴和發(fā)育著的中胚層中被發(fā)現(xiàn)，是一種具有鋅指結構的上皮-間質轉化(EMT)轉錄因子。近年研究發(fā)現(xiàn)，SLUG在乳腺癌[1]、肺癌[2]、卵巢癌[3]和胰腺癌[4]等多種癌癥中發(fā)揮著促癌作用。我們的前期研究證實，SLUG蛋白在卵巢癌中有表達上調的現(xiàn)象，但其具體作用機制尚不明了。本實驗利用改良的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，通過將特異結合SLUG基因的一對單導RNA(sgRNA)插入到能表達Cas9n核酸切口酶的質粒pSpCas9n(BB)-2A-Puro(PX462)中，該表達質?？蓪崿F(xiàn)靶向敲除目的基因，構建出敲除SLUG基因的卵巢癌SKOV3細胞穩(wěn)定株。同時利用慢病毒(Lentivirus)載體在SKOV3細胞中建立穩(wěn)定過表達SLUG蛋白的細胞株，為進一步探討SLUG在卵巢癌中的作用機制提供必要的細胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料 SKOV3細胞為本實驗室所保存。質粒pCMV-Myc-SLUG由湘雅醫(yī)學院向波教授饋贈。慢病毒表達質粒pLVX-IRES-Hyg(圖1)、包裝質粒1和2是由天津醫(yī)科大學生物化學與分子生物學系石磊教授饋贈。真核細胞表達質粒pSpCas9n(BB)-2A-Puro(PX462)由天津醫(yī)科大學細胞生物學系吳旭東教授惠贈。限制性內切酶BbsⅠ、XhoⅠ和BamHⅠ以及T4 DNA連接酶均購自Fermentas公司。去內毒素質粒提取試劑盒購自Omega公司。BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自Pierce公司。ECL Western 顯色試劑盒購自碧云天公司。兔源抗SLUG單克隆抗體購自CST公司，鼠源抗β-actin單克隆抗體購自Sigma公司，辣根過氧化物酶標記的鼠源、兔源IgG二抗購自Fermentas公司。序列合成和基因測序由上海英濰捷基公司完成。

1.2 慢病毒重組質粒pLVX-HA-SLUG的構建與鑒定 針對SLUG基因設計含有XhoⅠ和BamHⅠ限制性內切酶位點的SLUG克隆引物，且在上游引物中添加HA標簽，上游引物5′-GCCTCGAGATGTAC-CCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGCCGCGCTCC-TTCCTGGT-3′，下游引物5′-CGGGATCCTCAGTGTGCTACACAGCA-3′，產(chǎn)物大小807 bp。以質粒pCMV-Myc-SLUG為模板PCR擴增出HA-SLUG基因片段。利用限制性內切酶XhoⅠ和BamHⅠ同時對HA-SLUG基因片段和慢病毒質粒pLVX-IRES-Hyg進行雙酶切，并將兩者的酶切產(chǎn)物進行連接。將連接后的產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，接種于含氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)皿過夜，第2天挑取單克隆菌落。菌液PCR陽性者提取質粒，進行PCR和雙酶切鑒定，鑒定正確的質粒進行DNA測序驗證。

圖1 慢病毒表達質粒pLVX-IRES-Hyg圖譜

1.3 慢病毒包裝 將包裝質粒1、2和重組質粒pLVX-HA-SLUG以一定的比例加入到opti-MEM中混勻，另用opti-MEM將轉染試劑PEI預混。室溫靜置后將兩者混合。取出準備好的293T細胞，將質粒與轉染試劑的混合液緩慢加入到培養(yǎng)基中。分別于24、48 h收集2次病毒備用。同時以相同條件制備pLVX-IRES-Hyg空載體的慢病毒作為陰性對照。

1.4 慢病毒感染SKOV3細胞并篩選穩(wěn)定株 將獲得的病毒感染SKOV3細胞，同時設置陰性對照組。48 h后用藥物Hygromycin B進行篩選。待不做任何處理的空白對照組細胞全部死掉即停止加藥，細胞長滿后采用Western blotting法檢測SLUG蛋白表達。

1.5 設計特異結合SLUG基因的sgRNA 在http://crispr.mit.edu/網(wǎng)站設計一對特異結合SLUG基因的sgRNA并對其進行修改：上游引物序列(sgRNA-A)5′-CACC-GCGGTAGTCCACACAGTGAT-3′及其互補鏈5′-AAAC-ATCACTGTGTGGACTACCGC-3′，下游引物序列(sgRNA-B)5′-CACC-G-TTCCACGCCCAGCTACCCAA-3′及其互補鏈5′-AAAC-TTGGGTAGCTGGGCGTGGAA-C-3′。將修改后的序列交由上海生物工程有限公司進行合成。

1.6 重組質粒PX462-sgRNA的構建及鑒定用限制性內切酶BbsⅠ將質粒PX462線性化并分別與sgRNA-A、sgRNA-B連接，將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆搖菌并提取質粒，對質粒進行酶切和測序驗證。

1.7 重組質粒PX462-sgRNA共轉染SKOV3細胞并篩選穩(wěn)定株 根據(jù)Lipofectamine?3000轉染試劑的說明書，將重組質粒PX462-sgRNA-A、PX462-sgRNA-B共轉染SKOV3細胞，48 h后用藥物Puromycin進行篩選，直至未做任何處理的對照組細胞全部死掉即停止加藥，待細胞長滿后用Western blotting法檢測SLUG蛋白表達。若SLUG表達顯著降低則挑取單克隆菌落，篩選穩(wěn)定敲除SLUG的細胞株。

2 結果

2.1 重組質粒pLVX-HA-SLUG的鑒定 對挑取的單克隆菌液進行PCR擴增(圖2)，陽性者提取質粒進行PCR和雙酶切(圖3、4)，兩者驗證正確后進行DNA測序鑒定。結果均證實重組質粒構建成功。

注：M：DNA aker；A：1～15為陽性克隆菌落PCR產(chǎn)物；B：1，2，5，13，14號為陽性克隆菌落PCR產(chǎn)物；-：陽性對照；+：陽性對照。

圖2重組質粒pLVX-HA-SLUG菌落PCR鑒定

2.2 重組質粒pLVX-HA-SLUG感染SKOV3細胞效率的鑒定 將感染慢病毒質粒pLVX-HA-SLUG后的SKOV3細胞采用Western blotting法檢測SLUG蛋白表達水平。結果顯示，對照組與實驗組SLUG蛋白相對表達量分別為0.92±0.02和3.14±0.04。實驗組SLUG蛋白表達高于對照組(P<0.01)。說明SKOV3細胞過表達SLUG的穩(wěn)定株構建成功。

2.3 重組質粒PX462-sgRNA的鑒定 對重組質粒PX462-sgRNA-A、B進行酶切及測序驗證(圖5)，結果表明質粒構建成功。

注：M：DNA Maker；a：質粒pLVX-IRES-Hyg；b：質粒pLVX-IRES-Hyg雙酶切；c：PCR產(chǎn)物雙酶切。

圖3pLVX-IRES-Hyg雙酶切鑒定

注：M：DNA Maker；a：重組質粒pLVX-HA-SLUG；b：重組質粒pLVX-HA-SLUGPCR產(chǎn)物；c：重組質粒pLVX-HA-SLUG雙酶切；+：陽性對照。

圖4重組質粒PCR、雙酶切鑒定

注：M：DNA Maker；a、d：質粒PX462及酶切；b、e：重組質粒PX462-sgRNA-A及酶切；c、f：重組質粒PX462-sgRNA-B及酶切。

圖5重組質粒酶切鑒定

2.4 重組質粒PX462-sgRNA對SKOV3轉染效率的鑒定 重組質粒PX462-sgRNA共轉染SKOV3細胞后，通過Western blotting方法檢測挑取的4個單克隆細胞SLUG蛋白的表達情況。結果顯示，4個實驗組SLUG蛋白相對表達量分別為0.07±0.01、0.06±0.01、0.21±0.02、0.20±0.01，對照組為0.56±0.03。實驗組SLUG蛋白相對表達量低于對照組(P均<0.01)。結果證實穩(wěn)定敲除SLUG蛋白的SKOV3細胞株構建成功。

3 討論

SLUG蛋白是一種具有鋅指結構的EMT的轉錄因子。鋅指結構位于SLUG蛋白的C-末端，可與DNA的特異序列相結合，N-末端有介導轉錄抑制的SNAG結構域，可抑制靶基因的表達。已有文獻報道，SLUG基因參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。2009年，Chou等[5]在肺腺癌中發(fā)現(xiàn)CLU通過調節(jié)ERK/SLUG通路最終導致腫瘤細胞EMT的發(fā)生。2011年，Vuoriluoto等[6]在對乳腺癌細胞的研究中發(fā)現(xiàn)異位表達的SLUG蛋白可調節(jié)波形蛋白、E-cadherin和β-catenin等EMT相關蛋白的表達進而誘導EMT的發(fā)生。2013年，Li等[7]在結腸癌細胞中發(fā)現(xiàn)FAM3B持續(xù)過表達可使SLUG的表達上調，進而促進腫瘤細胞的侵襲和遷移。除此之外，SLUG蛋白還可通過TGF-β/SMAD[8]、NF-κB/HIF-1α[9]和MAPK/PI3K[10]等多種信號轉導途徑直接或間接誘導某些腫瘤相關分子的表達，在腫瘤EMT進程以及癌細胞的侵襲[11]和遷移[4]等特性中起著非常重要的作用。

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，對女性的身體健康造成嚴重的威脅。近年來，隨著社會的發(fā)展卵巢癌的發(fā)病率不斷上升，且發(fā)病年齡越來越趨于年輕化。因此針對卵巢癌發(fā)生發(fā)展的機制研究顯得尤為重要。我們前期研究已經(jīng)證實SLUG蛋白在卵巢癌中有表達上調的現(xiàn)象，同時我們還發(fā)現(xiàn)SND1蛋白、波形蛋白、E-cadherin、Claudin1等腫瘤相關分子的表達與SLUG蛋白表達水平有關，表明其與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系。為了探討SLUG在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中的作用及其與腫瘤相關分子的關系，我們首先通過慢病毒載體和改良的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在卵巢癌SKOV3細胞中分別構建了過表達和穩(wěn)定敲除SLUG基因的細胞株，通過觀察該蛋白對SKOV3細胞株增殖、侵襲和遷移能力的影響，進而對其在腫瘤轉移中的作用機制進行深入研究，從而為抑制卵巢癌的侵襲和遷移提供新策略，為卵巢癌的防治提供新的突破點。

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EstablishmentofovariancancerstableSKOV3celllineswithoverexpressionandknockoutofSLUGprotein

LEI Jing, ZHAO Ran, GAO Ru, XIN Lingbiao, LIU Xin

(Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China)

ObjectiveTo establish the ovarian cancer stable SKOV3 cell lines with overexpression and knockout of SLUG protein by lentiviral vector and modified CRISPR/Cas9 gene editing system, respectively.Methods①The HA-SLUG gene cloned from plasmid pCMV-Myc-SLUG was inserted into lentiviral vector pLVX-IRES-Hyg. The recombinant plasmid pLVX-HA-SLUG was used to infect SKOV3 cells (experimental group). The lentivirus of pLVX-IRES-Hyg empty vector was prepared as the negative control group under the same conditions. The expression of SLUG protein was detected by Western blotting. ② A pair of sgRNAs specifically binding to SLUG gene was inserted into the vector PX462. The pair of recombinant plasmids was transfected into SKOV3 cells by Lipofectamine method. We screened the stable cells, and selected monoclonal cells as the experimental group. The expression of SLUG protein was detected by Western blotting. Meanwhile, and the blank control group without any treatment was set up.Results①PCR was performed on the extracted monoclonal bacteria, and the positive ones were extracted and identified by PCR and double digestion. The results showed that the recombinant plasmid was successfully constructed. The expression levels of SLUG protein in the negative control group and the experimental group were 0.92±0.02 and 3.14±0.04, respectively. The expression of SLUG protein in the experimental group was higher than that in the negative control group (P<0.01). ②The four positive monoclonal cells were measured. The relative expression levels of SLUG protein were 0.07±0.01, 0.06±0.01, 0.21±0.02 and 0.20±0.01, respectively, and that in the blank control group was 0.56±0.03. The relative expression of SLUG protein in the experimental group was lower than that in the blank control group (allP<0.01).ConclusionTwo stable SKOV3 cell lines with SLUG protein overexpression and knockout were constructed successfully, which provided the essential cell models for further study about the role of SLUG protein in human ovarian cancer.

SLUG gene; lentiviral vector; SKOV3 cells； ovarian carcinoma; cell model

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.42.001

R737.31

A

1002-266X(2017)42-0001-04

天津市自然科學基金資助項目(17JCQNJC12600)。

雷靜(1989-)，女，碩士研究生，主要研究方向為醫(yī)學生物化學與分子生物學。E-mail: xqytqz@163.com

劉欣(1969-)，女，碩士生導師，副教授，主要研究方向為醫(yī)學生物化學與分子生物學。E-mail: xinliu_0828@tmu.edu.cn

2017-05-01)