風濕痹痛方對膠原誘導型關節炎大鼠血清細胞因子及滑膜組織Fas/FasL mRNA表達的影響

梁衛+周群+沈家敏+吳艮艮+張麗玲+陳曄+姚亮宇

摘要：目的 觀察風濕痹痛方對膠原誘導型關節炎（CIA）大鼠血清細胞因子及滑膜組織Fas/FasL mRNA表達的影響，探討其相關的作用機制。方法 采用大鼠足部皮內注射牛Ⅱ型膠原乳化劑方法建立CIA模型。實驗大鼠隨機分為空白組、模型組、雷公藤多苷組和風濕痹痛方低、中、高各劑量組，各給藥組給予相應藥物灌胃，連續14 d。觀察各組大鼠體質量和關節炎評分；ELISA檢測血清白細胞介素（IL）-1β、IL-15、轉化生長因子（TGF）-β1含量；RT-PCR檢測滑膜組織Fas、FasL的mRNA表達。結果 與模型組比較，風濕痹痛方中、高劑量組大鼠足部關節炎評分和血清IL-15含量顯著降低，TGF-β1含量顯著升高（P<0.01），風濕痹痛方高劑量組Fas mRNA表達顯著降低，FasL mRNA表達顯著升高（P<0.05）。結論 風濕痹痛方對CIA有一定的免疫調節作用，其機制可能是通過調控Fas/FasL凋亡系統，誘導滑膜組織細胞凋亡，抑制滑膜增生。

關鍵詞：風濕痹痛方；膠原誘導型關節炎；炎性因子；細胞凋亡；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.12.013

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）12-0052-04

Effects of Fengshi Bitong Prescription on Cytokines in Serum and Synovial Fas/FasL mRNA Expression in Rats with Collagen-Induced Arthritis LIANG Wei1， ZHOU Qun2， SHEN Jia-min2， WU Gen-gen2， ZHANG Li-ling1， CHEN Ye1， YAO Liang-yu3 （1. No.454 Hospital of PLA， Nanjing 210002， China； 2.Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China； 3. Xuzhou Medical University， Xuzhou 221004， China）

Abstract： Objective To observe the effects of Fengshi Bitong Prescription （FSBT） on cytokines in serum and Fas/FasL mRNA expression system in synovium； To discuss relevant mechanism of action. Methods Rats were given foot intradermal injection of bovine type Ⅱ collagen emulsion to establish collagen-induced arthritis （CIA） model. After successful modeling， they were randomly divided into 6 groups： normal control group， CIA model group， tripterygium glycosides group， FSBT high-， medium-， and low-dose groups. Each medication group was given relevant medicine for gavage for 14 d. The weight and arthritis scores of CIA rats were observed. Serum levels of IL-1β， IL-15， and TGF-β1 were detected by ELISA. Expressions of Fas and FasL mRNA in synovium of CIA rats were detected by real-time PCR. Results Compared with model group， the foot arthritis score and serum levels of IL-15 in FSBT high- and medium-dose groups significantly decreased （P<0.01）， and the serum level of TGF-β1 significantly increased （P<0.05）. Expression of Fas significantly decreased and FasL significantly increased in FSBT high-dose group （P<0.05）. Conclusion FSBT may have certain immune regulation effects on rheumatoid arthritis. Its mechanism may be in regulating Fas/FasL apoptosis system， thereby inducing apoptosis of synovial cells and inhibiting synovial hyperplasia.

Key words： Fengshi Bitong Prescription； collagen-induced arthritis； cytokine； apoptosis； rats

類風濕關節炎是一種以關節滑膜慢性炎癥為主的全身性慢性自身免疫系統疾病，伴有關節滑膜增生、關節軟骨、骨組織破壞，嚴重可導致關節畸形及功能喪失，其主要病機為氣血虧虛、風寒濕邪外侵、化毒內郁、氣滯血瘀、脈絡痹阻。前期研究表明，風濕痹痛方對類風濕關節炎模型大鼠具有免疫調節作用，可提高caspase-8的表達，影響Fas/FasL介導的滑膜細胞凋亡，減少關節損傷[1]。本實驗采用大鼠足部皮內注射牛Ⅱ型膠原乳化劑，建立膠原誘導型關節炎（CIA）模型，觀察風濕痹痛方對CIA大鼠血清白細胞介素（IL）-1β、IL-15、轉化生長因子（TGF）-β1含量及滑膜組織Fas、FasL mRNA表達的影響，探討其相關的作用機制，為風濕痹痛方的臨床應用提供實驗依據。endprint

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠60只，鼠齡8周，體質量220～250 g，上海杰思捷實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（滬）2013-0003。飼養于室溫（24±1）℃、相對濕度（55±10）%的環境，光照明暗交替12 h/12 h，自由飲水攝食。

1.2 藥物

風濕痹痛方（桂枝10 g、黃芪20 g、赤芍15 g、白芍15 g、當歸10 g、細辛3 g、追地風15 g、忍冬藤15 g等），南京中醫藥大學提供，批號20170125；雷公藤多苷片，上海復旦復華藥業有限公司，批號170108。

1.3 主要試劑與儀器

牛Ⅱ型膠原，Chondrex公司；弗氏完全佐劑，美國Sigma公司；大鼠IL-15、IL-1β和TGF-1β ELISA試劑盒，南京金益柏有限公司；Fas一抗，美國Proteintech公司；FasL一抗，北京博奧森生物公司。酶標儀（美國Bio-Tek公司），電泳儀（美國Bio-Rad公司），Lightcycler 96型PCR，Roche公司。

2 實驗方法

2.1 造模

參照文獻[2-3]方法造模。取適量牛Ⅱ型膠原，加入0.1 mol/L冰乙酸，4 ℃振蕩過夜，濃度為8 mg/mL，再按1∶1加入弗式完全佐劑充分混合乳化，制成Ⅱ型膠原蛋白乳化劑，最終濃度為4 mg/mL。60只SD大鼠隨機選取50只，右后足跖皮內注射0.1 mL/只膠原蛋白乳化劑制備CIA模型。造模后大鼠右后側足部紅腫明顯、體積增大，表明造模成功。

2.2 分組和給藥

將成模大鼠隨機分為模型組、雷公藤多苷片組（7.5 mg/kg）和風濕痹痛方低、中、高劑量組（9.5、19、38 g/kg），每組10只，其余10只大鼠為空白組。致炎第14日開始，各給組給予相應濃度藥液灌胃，空白組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。給藥體積為1 mL/100 g，每日1次，連續14 d。

2.3 體質量和足部關節炎評分

大鼠適應環境1周后，每周稱量大鼠體質量，同時每隔1周進行大鼠足部關節炎測定評分，觀察大鼠繼發性病變。根據《中藥藥理實驗方法學》[4]進行評分。0分：正常；1分：腳踝關節出現紅斑及輕微腫脹；2分：踝關節到趾關節或掌關節紅斑和輕微腫脹；3分：踝關節到趾關節或掌關節出現紅斑和中度腫脹；4分：踝關節到趾關節出現紅斑和重度腫脹。

2.4 白細胞介素-1β、白細胞介素-15、轉化生長因子-β1含量檢測

當日末次給藥1 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉，取腹主動脈血，3000 r/min離心10 min，取血清-20 ℃保存。采用血清IL-1β、IL-15、TGF-β1 ELISA試劑盒測定含量，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

2.5 滑膜組織Fas、FasL mRNA表達檢測

將從大鼠后腿取出來的滑膜組織做成組織勻漿，Trizol法提取RNA，按PCR操作說明書檢測滑膜組織Fas、FasL mRNA表達。基因引物見表1。

3 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 風濕痹痛方對模型大鼠體質量和足部關節炎評分的影響

各組大鼠體質量未見明顯差異，見表2。模型組大鼠關節炎評分較空白組差異明顯；雷公藤多苷片組大鼠關節炎評分第21、28日和風濕痹痛方中、高劑量組大鼠第28日關節炎評分顯著降低，與模型組比較差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01），見表3。

4.2 風濕痹痛方對模型大鼠血清相關細胞因子含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清IL-15、IL-1β含量顯著升高，TGF-β1含量明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，風濕痹痛方高、中劑量組血清IL-15含量顯著降低，TGF-β1含量明顯升高（P<0.01），IL-1β含量各劑量組有下降趨勢（P>0.05）。結果見表4。

4.3 風濕痹痛方對模型大鼠滑膜組織Fas、FasL mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織Fas mRNA表達顯著升高，FasL mRNA表達顯著下降，差異均有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，風濕痹痛方高劑量組和雷公藤多苷片組Fas mRNA表達顯著下降，FasL mRNA表達顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。結果見表5。

5 討論

類風濕關節炎屬中醫學“痹證”范疇。風濕痹痛方中桂枝、追地風、細辛祛風散寒、溫經通絡，黃芪、白芍、當歸益氣養血、活血通絡，忍冬藤、赤芍清熱解毒消腫、涼血化瘀。全方共奏補益氣血、祛風散寒、溫經通絡、解毒消腫、行氣活血、化瘀止痛之功。類風濕關節炎是以關節滑膜慢性炎癥為主要表現的自身免疫性疾病，其致病與多種免疫活性細胞的活化及細胞因子、炎癥介質相關，并與滑膜組織細胞凋亡障礙、滑膜增生相關。

IL-l主要來源于單核細胞及巨噬細胞，是類風濕關節炎炎癥相關的重要細胞因子，刺激B細胞和T細胞釋放細胞因子和抗體，同時刺激軟骨細胞和滑膜細胞釋放細胞毒素。1L-15主要由黏附性外周血單個核細胞產生，可以促進淋巴細胞、自然殺傷細胞的增殖、分化和調控，誘導T細胞的活化和免疫球蛋白的分泌，能刺激TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、單核細胞趨化蛋白-1和IL-17等炎性細胞因子的產生，增強或促進血管內皮細胞與白細胞間的黏附，有助于白細胞聚集于炎癥局部，并通過增加Bcl-x（L）和Bcl-2的表達，促進滑膜T細胞增殖。TGF-β1是一種重要的調節細胞生長、分化的多肽因子，具有調控血管內皮細胞生長、炎癥細胞趨化、成纖維細胞增生及細胞外基質的合成與降解等作用，其在類風濕關節炎的發病中起重要作用[5]。Fas又稱為CD95，該蛋白體的C端在細胞膜內，負責傳遞細胞凋亡的信號，N端在細胞膜外，負責與特異性Fas配體（FasL）結合并誘導細胞程序性死亡。研究發現，類風濕關節炎時滑膜細胞增生，與凋亡抑制有關，Fas/FasL系統在類風濕關節炎的病理過程中具有重要調控作用[6-7]。endprint

本實驗結果表明，風濕痹痛方可降低CIA大鼠關節炎評分，顯著下調血清IL-15水平，明顯升高TGF-β1含量，顯著下調Fas mRNA表達，顯著升高FasL mRNA表達。綜上所述，風濕通痹方能抑制膠原性關節炎的炎癥反應，具有免疫調節作用，并調控Fas/FasL凋亡系統，誘導滑膜細胞凋亡，抑制滑膜增生。本研究僅為風濕痹痛方藥效和機制的初步探討，今后將進一步開展細胞水平、蛋白表達水平研究，深入闡明該方的作用機理。

參考文獻：

[1] 梁衛，梁濤，張麗玲，等.風濕痹痛方治療大鼠膠原性關節炎的實驗研究[J].中國中醫急癥，2017，26（1）：83-85.

[2] 李寶麗，唐方，龐曉東.Ⅱ型膠原誘導關節炎大鼠模型制備[J].中國免疫學雜志，2006，22（4）：350.

[3] 陳奇.中藥藥理研究方法學[M].北京：人民衛生出版社，2006：347.

[4] 魏偉，吳希美.李元建.藥理實驗方法學[M].北京：人民衛生出版社， 2010：663.

[5] 孫麗霞.轉化生長因子-β1與類風濕關節炎[J].河北醫科大學學報， 2002，23（5）：310-312.

[6] PERLMAN H， PAGLIARI L J， LIU H， et al. Rheumatoid arthritis synovial macrophages express the Fas assciated death domain-like interleukin-1 beta-converting enzyme-inhibitory protein and are refractory to Fas mediated apoptosis[J]. Arthritis Rheum，2001， 44（1）：21-30.

[7] DRYNDA A， QUAX P H， NEUMANN M， et al. Gene transfer of tissue inhibitor of metalloproteinases-3 reverses the inhibitor effects of TNF-alpha on Fas-induced apoptosis in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts[J]. J Immunol，2005，174（10）：6524-6531.

（收稿日期：2017-05-08）

（修回日期：2017-06-11；編輯：華強）endprint