焦磷酸測序檢測CYP2C19基因多態性方法的建立

楊楠楠+徐琴+羅振元+付雪++黃盛文

[摘要] 目的 建立一種基于焦磷酸測序技術的用于CYP2C19基因多態性快速檢測的方法。 方法 選擇2016年12月～2017年3月于貴州省人民醫院行健康體檢者50名，提取其基因組DNA，針對CYP2C19*2（681G>A）、CYP2C19*3（636G>A）、CYP2C19*17（-806C>T）3個單核苷酸多態性（SNP）位點分別設計一套PCR擴增引物和焦磷酸測序引物。將PCR擴增產物制備成單鏈測序模板，用Qiagen PyroMark Q24焦磷酸測序儀進行測序和基因型分析，采用Sanger一代測序技術對焦磷酸測序結果進行驗證。 結果 根據出峰的堿基和峰高可清楚判斷出3個SNP位點的不同基因型，檢測結果與Sanger測序結果完全一致。50名健康體檢者中檢出CYP2C19超快代謝型1例，快代謝型22例，中代謝性22例，慢代謝型5例。 結論 本研究建立的焦磷酸測序檢測CYP2C19基因多態性的方法具有快速、準確、成本低的特點，適用于臨床實驗室對CYP2C19基因多態性的分型。

[關鍵詞] CYP2C19；基因多態性；焦磷酸測序；氯吡格雷

[中圖分類號] R446.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（b）-0011-04

Establishment of genotyping methods for polymorphisms of CYP2C19 gene based on pyrosequencing technology

YANG Nannan1 XU Qin1 LUO Zhenyuan2 FU Xue2 HUANG Shengwen2▲

1.School of Clinical Laboratory Science， Guizhou Medical University， Guizhou Province， Guiyang 550004， China； 2.Department of Clinical Laboratory， Guizhou Provincial People′s Hospital， Guizhou Province， Guiyang 550002， China

[Abstract] Objective To establish a fast detection method for CYP2C19 genotyping based on pyrosequencing technology. Methods Genomic DNA was extracted from 50 blood samples of healthy subjects collected from December 2016 to March 2017 in Guizhou Provincial People′s Hospital， and a set of amplification primers and pyrophosphate sequencing primers were designed according to the single nucleotide polymorphism （SNP） sites of CYP2C19*2 （681G>A）， CYP2C19*3 （636G>A）， CYP2C19*17 （-806C>T）. Single-stranded templates were made from PCR products， then sequencing and genotyping analysis were performed on a Qiagen PyroMark Q24 Sequencer System. The sequencing results were verified via Sanger sequencing. Results Based on the type and peak height of bases of DNA sequence， the genotypes of three SNPs could be identified clearly， which were consistent with Sanger sequencing results. Among the 50 samples of healthy group， 1 case was ultra-rapidmetabolism， 22 cases were rapidmetabolism， 22 cases were medium metabolism and 5 cases were slow metabolism. Conclusion The detection method of CYP2C19 polymorphism based on pyrosequencing technology is quick， accurate and convenient， which can be used to analyze the genotyping of CYP2C19 gene polymorphism.

[Key words] CYP2C19； Gene polymorphism； Pyrosequencing； Clopidogrel

氯吡格雷是臨床上常用的抗血小板聚集的藥物之一，冠狀動脈介入術（percutaneous coronary intervention，PCI）后患者需長期服用氯吡格雷來進行抗血小板治療[1-2]，但臨床上部分患者會出現氯吡格雷抵抗[3]。氯吡格雷的主要代謝酶為細胞色素P4502C19[4-6]，其編碼基因CYP2C19的多態性是影響氯吡格雷療效的主要遺傳因素[7-8]。CYP2C19的等位基因以CYP2C19*1（野生型）、CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17較常見[9]。超快代謝型的基因型為*1/*17、*17*17，快代謝型的基因型為*1/*1，中代謝型的基因型為*1/*2、*1/*3，慢代謝型的基因型為*2/*2、*3/*3和*2/*3[10-11]。本研究采用焦磷酸測序技術建立了一種CYP2C19基因多態性檢測方法，并用Sanger測序法對其準確性進行驗證。endprint

1 對象與方法

1.1 對象

選擇2016年12月～2017年3月貴州省人民醫院健康體檢成人50名，其中男21名，女29名，平均年齡為（35.7±9.7）歲。

1.2 主要儀器與試劑

NP968核酸自動提取儀（西安天隆科技有限公司）；美國ABI Veriti96 PCR儀（美國ABI生物系統公司）；Qiagen PyroMark Q24焦磷酸測序儀（德國凱杰公司）；PCR擴增引物和焦磷酸測序引物（上海生工生物有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取 根據天隆NP968核酸自動提取儀的說明書進行全血DNA提取，對DNA樣本進行濃度和純度檢測，置于-20℃保存備用。

1.3.2 CYP2C19多態性位點的引物設計 在NCBI上分別下載CYP2C19*2（681G>A）、CYP2C19*3（636G>A）和CYP2C19*17（-806C>T）3個單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點上下游各1 kb范圍的基因序列，采用PyroMark Assay Design Software 2.0（德國凱杰公司）軟件設計PCR引物和焦磷酸測序引物。見表1。

1.3.3 PCR擴增 25 μL PCR反應體系包括：PyroMark PCR Master Mix 12.5 μL，CoraLoad Concentrate 2.5 μL，Q-Solution 5 μL，25 mmol/L MgCl2 1.5 μL，上下游PCR引物各0.5 μL，DNA 1 μL，RNase-free water 1.5 μL。PCR反應條件：95℃預變性15 min，94℃變性30 s，CYP2C19*2 50℃、CYP2C19*3 53℃、CYP2C19*17 49℃退火30 s，72°C延伸30 s，共45個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物經過2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測是否為所需的目的片段。

1.3.4 制備預混液以固定PCR產物 80 μL反應體系包括Beads 2 μL，Binding buffer 40 μL，PCR產物10 μL，高純水28 μL。

1.3.5 單鏈的分離 將0.3 μmol/L測序引物分配到q24反應板的每個孔中。打開開關，將真空工具放到PCR管的孔中，持續15 s，以捕獲帶有PCR產物的sepharose珠。依次用70%乙醇、變性溶液、洗滌液沖洗真空工具10 s，關閉真空開關。將真空工具放到孔中，左右輕柔晃動，以釋放含有磁珠的產物。

1.3.6 測序引物與DNA鏈退火 將q24反應板置于80℃加熱塊上加熱樣本2 min，樣本冷卻至室溫（15～25℃）后即可放入焦磷酸測序儀內測序。

1.3.7 基因型分析 通過Qiagen PyroMark Q24（德國凱杰公司）軟件對結果進行分析，根據出峰的堿基和峰高分別判斷各位點的基因型。

1.3.8 Sanger測序驗證 將3個SNP位點的PCR產物送上海生工生物有限公司采用Sanger測序法進行檢測，并與焦磷酸測序結果進行比對。

2 結果

2.1 PCR結果

電泳結果顯示，3個SNP位點的PCR產物均在相應位置呈單一條帶。見圖1。

2.2 3個SNP位點的基因型檢測結果

3個SNP位點均可通過出峰的堿基和峰高清楚判斷出不同的基因型，信噪比較高，非特異峰的比例均在10%以內。50個樣本中3個位點的基因型與Sanger測序結果完全一致。見圖2～4（左側為焦磷酸測序檢測結果，右側為Sanger測序結果）。

2.3 50名樣本CYP2C19基因型檢測結果

根據3個SNP位點的檢測結果，可以得出每個樣本的CYP2C19基因型，并判斷出其代謝類型。50名健康體檢者中檢出超快代謝型1例，快代謝型22例，中代謝性22例，慢代謝型5例。見表2。

CYP2C19的4種等位基因頻率顯示，野生型CYP2C19*1所占比例為67.0%，其次是CYP2C19*2，占29.0%。見表3。

3 討論

檢測CYP2C19多態性的方法除了金標準Sanger測序技術外，常用的還有限制性片段長度多態分析、飛行時間質譜[12]、DNA微陣列芯片、高分辨率熔解曲線分析、Taqman探針等技術[13]。這些技術均具有較高的準確性，但操作步驟較為繁瑣，或是需要依賴昂貴的儀器，檢測成本較高，不適合規模的推廣應用。為適應臨床對CYP2C19基因多態性檢測的需要，有必要建立一種高效、快速、準確度高、靈敏度好、經濟適用的檢測方法。

焦磷酸測序是一種基于DNA序列分析的技術，是檢測SNP最為準確的方法之一[14]。焦磷酸測序適用于對已知短序列的測序分析，其敏感性和精確性能與金標準（Sanger測序法）相提并論，并能夠實時、直觀、準確、定量提供待測序列的信息[15-17]，已廣泛用于基因多態性檢測、微生物分型、基因甲基化檢測等領域[18]。

本研究建立的焦磷酸測序檢測方法可對CYP2 C19基因進行快速、準確的分型，可在20 min內對24個標本進行平行檢測，檢測結果與Sanger測序結果完全一致，并且檢測成本低于Sanger測序法。另外，由于人群中等位基因CYP2C19*17的頻率較低，其他方法較少對其進行檢測，本研究建立的檢測方法包含了對CYP2C19*17的檢測，可更為全面地指導氯吡格雷的個體化用藥。

本研究共檢測到的5種CYP2C19基因型，其中超快代謝型（*1/*17）占2%，快代謝型（*1/*1）占44%，中間代謝型（*1/*2、*1/*3）占44%，慢代謝型（*2/*2）占10%。等位基因CYP2C19*1、CYP2C19*2、CYP2C19* 3、CYP2C19*17的頻率分別為67%、29%、3%和1%，與國內其他地區人群的研究結果基本一致[19-21]。endprint

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（收稿日期：2017-07-02 本文編輯：程 銘）endprint