rhGH聯合5-FU治療人胃癌裸小鼠皮下移植瘤的作用及機制

胡承浩，羅清欽，吳峰，王丹，朱圣明，陳宇，王科，柴晶晶，段奇文

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rhGH聯合5-FU治療人胃癌裸小鼠皮下移植瘤的作用及機制

胡承浩，羅清欽，吳峰，王丹，朱圣明，陳宇，王科，柴晶晶，段奇文

442000 十堰，湖北省十堰市太和醫院腫瘤科

探討重組人生長激素（rhGH）聯合氟尿嘧啶（5-FU）治療人胃癌裸小鼠皮下移植瘤的效果及作用機制。選取成功建模的人胃癌 MKN-45 裸鼠皮下移植瘤模型小鼠 72 只，采用隨機數字表法分為空白組（等量生理鹽水處理）、GH 組（rhGH 2 IU/(kg·d)）、5-FU 組（5-FU 25 mg/(kg·d)）、聯合組（rhGH 2 IU/(kg·d) + 5-FU25 mg/(kg·d)），每組 18 只，對比各組小鼠的體質量、荷瘤體積、抑瘤率、腫瘤細胞周期占比、腫瘤組織中 Caspase-8、Caspase-9 蛋白的表達，觀察小鼠的血生化指標。5-FU 組、聯合組小鼠荷瘤體積、荷瘤質量、S 期細胞占比顯著的低于空白組和 GH 組（< 0.05），抑瘤率、腫瘤細胞 G0 期/G1 期、G2 期/M 期占比、Caspase-8、Caspase-9 蛋白表達水平顯著的高于空白組和 GH 組（< 0.05）；5-FU 組與聯合組小鼠荷瘤體積、荷瘤質量及抑瘤率、腫瘤細胞 G0 期/G1 期、G2 期/M 期、S 期占比、Caspase-8、Caspase-9 蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（> 0.05）；5-FU 組的白蛋白、總蛋白、白細胞、紅細胞、血小板水平均低于空白組、GH 組及聯合組（< 0.05），谷丙轉氨酶水平高于空白組、GH 組及聯合組（< 0.05）；聯合組白細胞水平較空白組和 GH 組降低（< 0.05）。rhGH 聯合 5-FU 治療人胃癌裸小鼠皮下移植瘤不影響 5-FU 的抗癌效果，同時可以改善 5-FU 引起的體質量減低及相關化療毒副作用。

重組人生長激素； 氟尿嘧啶； 胃癌； 移植瘤

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其發病率較高，在我國所有惡性腫瘤中位居第 2 位，致死率位居第 3 位，嚴重威脅著人們的生命健康[1-2]。隨著醫療水平的不斷發展，胃癌的發病率有一定的下降，但仍然是目前威脅人們健康的主要疾病之一，其發病原因有很多，但多數與飲食有關[3-4]。目前臨床上一般采用外科手術的方式進行治療，但多數患者在確診時已為中晚期，單純手術并不能切除遠處的轉移灶，治療效果不理想，需給予化療進行輔助治療[5-6]。人生長激素是一種由垂體分泌的肽類激素，可促進蛋白質合成并減少分解代謝，并能改善氮平衡狀態[7]。也有研究表明[8]，人生長激素可能具有促進腫瘤細胞有絲分裂和腫瘤增長的潛在功能，但能否應用于腫瘤的治療仍不太清楚。為此，本研究選取成功建模的人胃癌 MKN-45 裸鼠皮下移植瘤模型小鼠，分別給予重組人生長激素（rhGH）、5-FU 以及 rhGH 聯合 5-FU 進行干預，探討分析了 rhGH 聯合 5-FU 治療人胃癌裸小鼠皮下移植瘤的效果及作用機制，旨在為臨床提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取人胃癌 MKN-45 細胞成功建模的 BALB/c-nude 人胃癌裸小鼠皮下移植瘤模型 72只，均為清潔級，體質量 18 ~ 22 g，購自復旦大學動物實驗中心，喂養于 23 ~ 25 ℃，相對濕度 45% ~ 60%，光照 12 h 的環境中。

1.1.2 實驗儀器與藥品 5-FU（0.25 g/10 ml）購自上海旭東海普藥業有限公司；重組人生長激素購自瑞士雪蘭諾藥廠；DMEM 干粉培養基、0.2% 胰酶、PI 及 Annexin V 均購自杭州四季青生物材料有限公司；溴化丙啶購自美國 Sigma 公司；胎牛血清、SP 免疫組化染色試劑盒和 DAB 顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物科技公司；Caspase-8 和 Caspase-9 鼠抗人單克隆抗體均購自晶美生物工程有限公司。

TDL-5 型離心機購自上海安亭儀器公司；LH50A 型顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；EPICS-XL 型流式細胞儀購自美國 Beckman Coulter 公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及干預方法 將 72 只小鼠隨機分為空白組、GH 組、5-FU 組和聯合組，每組18 只，其中 GH 組小鼠皮下注射 rhGH，劑量為2 IU/(kg·d)，5-FU 組小鼠腹腔注射 5-FU，劑量為 25 mg/(kg·d)，聯合組小鼠皮下注射 rhGH2 IU/(kg·d)，腹腔注射 5-FU 25 mg/(kg·d)，空白組每日皮下和腹腔分別注射生理鹽水 0.2和 0.5 ml，連續給藥 10 d。末次給藥 24 h 后處死裸鼠，將腫瘤組織完整剝除，觀察瘤體大體形態，一部分以 10% 多聚甲醛進行固定，常規石蠟包埋后作連續切片，厚度約為 5 μm；另一部分保存于–80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.2.2 免疫組化染色 將腫瘤組織切片脫蠟處理后采用免疫組化染色法（SP）進行染色，一抗為鼠抗人 Caspase-8、Caspase-9，二抗為生物素化標記的 IgG，以 PBS 代替一抗作為陰性對照，DAB 溶液顯色后蘇木精復染，甘油明膠封片后顯微鏡下觀察結果，具體檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 瘤體體積測量及腫瘤凋亡率計算 每 2 天采用游標卡尺測量 4 組小鼠荷瘤的長徑與橫徑，計算荷瘤體積 V = 長徑× 橫徑2/2，腫瘤細胞凋亡率=（空白組瘤體質量 – 實驗組瘤體質量）/空白組瘤體質量 × 100%。

1.2.4 腫瘤細胞周期分布檢測、血生化指標檢測方法 將腫瘤組織用眼科剪剪碎，并用眼科鑷子輕輕捻搓，以生理鹽水不斷沖洗，隨后將混濁液進行過濾，并以 1000 r/min 離心 10 min。棄掉上清液后將沉淀以 70%乙醇（4 ℃預冷）固定，加入 Rnase 酶進行消化，隨后在 4 ℃條件下加入 1 ml 溴化丙啶（PI）避光染色 30 min，過濾制成單細胞懸液，利用流式細胞儀進行檢測，同時應用MuticycleAV 分析軟件對 DNA 周期進行擬合分析，并計算出細胞周期分布的百分率。

末次給藥 24 h 后以摘除眼球法進行取血，檢測白蛋白、總蛋白、血常規、谷丙轉氨酶等常規生化指標。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 各組小鼠的體質量變化

給藥前，各組小鼠體質量差異無統計學意義（> 0.05）；給藥后，5-FU 組小鼠體質量較其他組顯著降低（< 0.05），GH 組、聯合組小鼠的體質量與空白組比較差異不具有統計學意義（> 0.05）（表 1）。

表 1 各組小鼠的體質量變化（，g）

注：*與空白組和 GH 組比較，< 0.05。

Note:*Compared with blank group,< 0.05.

2.2 各組小鼠的荷瘤體積、荷瘤質量、抑瘤率比較

5-FU 組、聯合組小鼠荷瘤體積、荷瘤質量顯著的低于空白組和 GH 組（< 0.05），抑瘤率顯著的高于空白組和 GH 組（< 0.05）；5-FU 組與聯合組小鼠荷瘤體積、荷瘤質量及抑瘤率比較，差異無統計學意義（0.05）（表 2）。

2.3 各組小鼠的腫瘤組織中細胞周期占比比較

5-FU 組、聯合組小鼠腫瘤細胞 G0 期/G1 期、G2 期/M 期占比高于空白組和 GH 組（< 0.05），S 期細胞占比顯著低于空白組和 GH 組（< 0.05）；5-FU 組與聯合組小鼠腫瘤細胞 G0 期/G1 期、G2 期/M 期、S 期占比比較，差異無統計學意義（> 0.05）（表 3）。

2.4 各組小鼠的腫瘤組織中 Caspase-8、Caspase-9 蛋白表達

5-FU 組、聯合組小鼠腫瘤 Caspase-8、Caspase-9 蛋白表達水平高于空白組和 GH 組（< 0.05）；5-FU 組與聯合組小鼠腫瘤 Caspase-8、Caspase-9 蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（> 0.05）（表 4）。

表 2 各組小鼠的荷瘤體積、荷瘤質量、抑瘤率比較（）

注：*與空白組比較< 0.05，#與 GH 組比較，< 0.05。

Note:*Compared with blank group,< 0.05,#Compared with the GH group,< 0.05.

表 3 各組小鼠的腫瘤組織中細胞周期占比比較（）

注：*與空白組和 GH 組比較，< 0.05。

Note:*Compared with blank group and GH group,< 0.05.

表 4 各組小鼠的腫瘤組織中 Caspase-8、Caspase-9蛋白比較（，OD值）

注：*與空白組和 GH 組比較，< 0.05。

Note:*Compared with blank group and GH group,< 0.05.

2.5 各組小鼠的血生化指標比較

5-FU 組的白蛋白、總蛋白、白細胞、紅細胞、血小板水平均低于空白組、GH 組及聯合組（< 0.05），谷丙轉氨酶水平高于空白組、GH 組及聯合組（< 0.05）；聯合組白細胞水平較空白組和 GH 組降低（< 0.05）（表 5）。

3 討論

胃癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，具有發病率高、死亡率高等特點，也是目前國際間最為重要的健康危機之一[9-10]。胃癌的發病與多種因素有關，如社會經濟狀況、飲食因素、環境因素等，而胃幽門螺桿菌感染、亞硝胺等化學致癌物質以及遺傳因素、霉菌感染及某些微量元素缺乏等因素都與其發生和發展有著密切的關系[11]。目前臨床上治療的方式主要是外科手術和放療、化療等，雖然能取得一定的效果，但多數患者就診時已屬晚期，手術效果較差，患者的生存率較低[12]。化療是治療中晚期胃癌患者的重要手段，其主要是利用化學藥物抑制腫瘤細胞的生長繁殖，或是大面積殺死腫瘤細胞和促進腫瘤細胞的分化，對腫瘤的原發灶、轉移灶和亞臨床轉移灶均有一定的治療作用，但長期治療會導致患者出現身體衰弱、精神萎靡不振、白細胞和血小板下降等嚴重的毒副作用，不利于患者的預后效果[13]。因此，如何尋找新型有效且副作用少的化療藥物來提高患者的預后也是目前廣大醫師關注的重點和難點。重組人生長激素具有糾正負氮平衡、促進傷口愈合及提高手術耐受性等作用，在臨床上得到了廣泛的應用，但其能否應用于腫瘤的治療仍未可知。但也有研究表明[14]，重組人生長激素與化療藥物可能有一定的協同作用，可提供化療藥物的療效，但其具體機制仍不太清楚。為了進一步探討rhGH 聯合 5-FU 治療人胃癌裸小鼠皮下移植瘤的效果及作用機制，本研究對 MKN-45 裸鼠皮下移植瘤模型小鼠分別給予 rhGH、5-FU 以及 rhGH 聯合 5-FU 進行干預，檢測分析了各組小鼠的體質量、荷瘤體積、抑瘤率、腫瘤細胞周期占比、腫瘤組織中 Caspase-8、Caspase-9 蛋白的表達以及血生化指標。

表 5 各組小鼠的血生化指標比較（）

注：*與空白組和 GH 組比較，< 0.05，#與聯合組比較，< 0.05。

Note:*Compared with blank group and GH group,< 0.05,#Compared with the combination group,< 0.05.

3.1 rhGH 聯合5-FU 對小鼠體質量變化的影響分析

研究表明，晚期腫瘤患者多伴有嚴重的代謝異常，機體營養不良的發生率很高，甚至會誘發惡病質的發生，嚴重影響腫瘤病人的生存期。營養不良或惡病質還會導致患者對化療的耐受性明顯降低，進而影響抗腫瘤的療效；而化療藥物的使用還可能會引起患者食欲不振等的發生，進一步加重營養不良。本研究發現，給藥后 5-FU 組小鼠體質量較其他組顯著降低，而 GH 組、聯合組小鼠的體質量與空白組比較差異不具有統計學意義，提示重組生長激素可明顯改善 5-FU 引起的體質量減低狀況，其原因可能是生長激素具有代謝調理作用，不但能促進蛋白質合成和維持氮平衡，還能增加脂肪氧化分解和糖異生，進而改善機體的營養狀態。

3.2 rhGH 聯合 5-FU 抗癌效果分析

Caspase-8 和Caspase-9 蛋白作為細胞凋亡的關鍵蛋白酶，其誘導表達與腫瘤細胞的凋亡發生和發展有著密切的聯系。本研究發現，5-FU 組、聯合組小鼠荷瘤體積、荷瘤質量顯著低于空白組和 GH 組，抑瘤率顯著高于空白組和 GH 組，但 5-FU 組與聯合組小鼠荷瘤體積、荷瘤質量及抑瘤率比較并無明顯差異。同時發現，5-FU 組與聯合組小鼠腫瘤細胞 G0 期/G1 期、G2 期/M 期、S 期占比比較差異也無統計學意義；5-FU 組與聯合組小鼠腫瘤 Caspase-8、Caspase-9 蛋白表達水平比較也無明顯差異，提示 rhGH 聯合 5-FU 并不會改變 5-FU 的抗腫瘤效果，具有一定的應用價值。也有研究表明，rhGH 聯合化療治療腫瘤可能會增加化療敏感性，進而提高療效，但具體機制仍需作進一步的研究[15]。

3.3 rhGH 聯合5-FU 減毒效果分析

5-FU 是目前較為常用的抗癌藥物之一，其對多種腫瘤如消化道腫瘤、乳腺癌、卵巢癌、絨毛膜上皮癌、子宮頸癌、肝癌、膀胱癌、皮膚癌（局部涂抹）、外陰白斑（局部涂抹）等均有一定療效，但 5-FU 也具有非常明顯的毒副作用，主要表現為骨髓抑制、胃腸道反應、脫發等。本研究發現，5-FU 組的白蛋白、總蛋白、白細胞、紅細胞、血小板水平均低于空白組、GH 組及聯合組，而谷丙轉氨酶水平高于空白組、GH 組及聯合組；聯合組白細胞水平較空白組和 GH 組降低，提示rhGH 聯合 5-FU 可明顯減輕 5-FU 的毒副作用，其機制可能是 rhGH 在改善機體營養不良和惡病質狀態的同時還能提高機體對化療的耐受性，進而減少并發癥的發生；rhGH 還具有增加機體免疫功能和細胞的活性的作用，可進一步降低化療藥物的毒副作用。但本研究限于研究樣本的不足，對于 rhGH 聯合 5-FU 治療胃癌的具體臨床應用價值仍需作進一步的深入研究。

綜上所述，hGH 聯合 5-FU 治療人胃癌裸小鼠皮下移植瘤不影響 5-FU 的抗癌效果，同時可以改善 5-FU 引起的體質量減低及相關化療毒副作用。

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Inhibitory effect of rhGH combined with 5-FU on human gastric cancer transplanted in nude mice

HU Cheng-hao, LUO Qing-qin, WU Feng, WANG Dan, ZHU Sheng-ming, CHEN Yu, WANG Ke, CHAI Jing-jing, DUAN Qi-wen

Oncology Department, Taihe Hospital, Shiyan 442000, China

To investigate the effect of recombinant human growth hormone (rhGH) in combination with fluorouracil (5-FU) on human gastric cancer subcutaneously transplanted in nude mice and its mechanism.72 MKN-45 tumor model nude mice were randomly divided into blank group (equal volume saline), GH group [rhGH2 IU/(kg·d)], 5-FU group [5-FU 25 mg/(kg·d)], and combination group [rhGH 2 IU/(kg·d) + 5-FU 25 mg/(kg·d)], The expression of Caspase-8 and Caspase-9 in tumor tissues were observed, and the blood biochemical indexes of the mice were measured.Tumor volume and mass, as well as S phase cell proportion in the 5-FU group was significantly lower than that in the control group and GH group (< 0.05), while the inhibition rate of tumor cells, and Caspase-8 and Caspase-9 expression levels were higher in the 5-FU group than that in the control group and GH group (< 0.05). No significant difference was seen between 5-FU group and combination group with regard to the tumor volume, tumor mass, the inhibition rate, cell cycle changes, as well as Caspase-8 and Caspase-9 protein expression (> 0.05). In the 5-FU group, the level of albumin, total proteins, and blood cells were lower, while alanine aminotransferase level was higher, than that in the control group, GH group and combination group (< 0.05).In combination group, level of white blood cells was decreased compared with that in the control group and GH group (< 0.05).rhGH in combination with 5-FU does not affect the anti-cancer effect of 5-FU in the treatment of human gastric cancer in nude mice, but can improve the side-effect caused by 5-FU with regard to the blood parameters.

Recombinant human growth hormone; Fluorouracil; Gastric cancer; Transplanted tumor

DUAN Qi-wen, Email: duanqiwen@taihehospital.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.007

段奇文，Email：duanqiwen@taihehospital.com

2017-07-21