非酒精性脂肪肝樣本庫質(zhì)控體系的建立

高芳芳，王婷婷，遲毓婧，葉磊，韓影，張育軍，劉玉蘭

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非酒精性脂肪肝樣本庫質(zhì)控體系的建立

高芳芳，王婷婷，遲毓婧，葉磊，韓影，張育軍，劉玉蘭

100044，北京大學(xué)人民醫(yī)院臨床分子生物學(xué)研究所（高芳芳、王婷婷、遲毓婧、葉磊、韓影、張育軍），消化內(nèi)科（劉玉蘭）

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，是以肝細(xì)胞脂肪變性和脂肪蓄積為病理特征，但無過量飲酒史的臨床綜合征[1]。隨著人們生活水平的提高，NAFLD 的發(fā)病率逐年升高。全球流行病學(xué)調(diào)查表明，成人的 NAFLD 發(fā)病率是20% ~ 33%，肥胖人群中發(fā)病率高達(dá) 75%，目前已成為一種嚴(yán)重威脅人類健康的常見的慢性肝病。現(xiàn)有研究表明脂肪肝不僅可以在數(shù)年后引起肝硬化，甚至與肝癌、結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，嚴(yán)重影響人們預(yù)期的壽命[2-3]。但其發(fā)病機(jī)制尚未明確，因此對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究就顯得尤為重要。

在臨床研究中，收集患者的生物樣本以及保證樣本質(zhì)量是一項(xiàng)很重要的工作。雖然我們?cè)谝酝鶚颖臼占倪^程中投入了大量的時(shí)間、財(cái)力、人力，但是由于樣本收集及后期的質(zhì)控不規(guī)范，所以不可避免地造成了樣本的流失、臨床資料的殘缺、樣本存放無序等一些問題，無法滿足后期的實(shí)驗(yàn)研究。NAFLD 樣本庫及質(zhì)控體系在樣本的采集、運(yùn)輸、入庫、質(zhì)檢等各個(gè)方面都做了系統(tǒng)和規(guī)范化的管理[4]。自 NAFLD 生物樣本庫質(zhì)控體系建立以來解決了 NAFLD 樣本收集過程中的各種難題，以下對(duì)其建設(shè)過程及方法作一詳細(xì)的報(bào)道。

1 生物樣本庫的建設(shè)

生物樣本庫建設(shè)目的是保障臨床組織標(biāo)本的采集、保存、使用的規(guī)范化，與國際標(biāo)準(zhǔn)接軌，根據(jù)臨床研究方向，留存患者知情同意書、樣本信息完整、標(biāo)本取材規(guī)范合理有效、標(biāo)本入庫規(guī)范化檔案化，為臨床科研服務(wù)提供優(yōu)質(zhì)的、珍貴的臨床生物標(biāo)本[5]。

1.1 人員管理

生物樣本庫工作人員需經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化的培訓(xùn)，使其對(duì)樣本的倫理審核、知情同意、采集、處理、貯存、注釋、檢索、檢測、出庫、運(yùn)輸、質(zhì)量管理等工作均能勝任。并定期進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作流程、安全操作、設(shè)備使用、樣本信息化管理等培訓(xùn)。

1.2 樣本庫硬件設(shè)施及環(huán)境

首先，為了滿足樣本貯存、處理、轉(zhuǎn)運(yùn)、信息保存、樣本質(zhì)量控制等相關(guān)需求。樣本庫要配備超低溫冰箱、液氮罐、離心機(jī)、生物安全柜、BRADY 打印機(jī)、條碼掃碼槍、冰臺(tái)等相關(guān)設(shè)備。

其次，為保證樣本質(zhì)量，超低溫冰箱需不間斷運(yùn)行。所以樣本庫需配備雙電路系統(tǒng)、空調(diào)排風(fēng)、新風(fēng)系統(tǒng)。同時(shí)樣本庫要進(jìn)行功能分區(qū)，需設(shè)立樣本接收室、樣本處理間、樣本貯存間、樣本信息錄入?yún)^(qū)域、樣本質(zhì)控區(qū)。為保證樣本庫的安全，在安全設(shè)施方面，樣本庫要配備超低溫冰箱冷鏈監(jiān)控系統(tǒng)、門禁系統(tǒng)、消防系統(tǒng)、人身安全防護(hù)設(shè)備。并對(duì)設(shè)備進(jìn)行專人管理，建檔受控，定期對(duì)超低溫冰箱進(jìn)行維護(hù)、保養(yǎng)，設(shè)立冰箱故障的應(yīng)急預(yù)案。

1.3 信息系統(tǒng)

建立一套信息全面而專業(yè)化的特色樣本庫管理系統(tǒng)，對(duì)患者各類樣本信息進(jìn)行完善的保存及管理，是有效進(jìn)行醫(yī)學(xué)研究的重要方法和手段[6-7]。信息系統(tǒng)會(huì)記錄捐獻(xiàn)者的相關(guān)情況、樣本的采集、運(yùn)輸、保存、使用情況，使樣本資料得到完整、規(guī)范的保存。系統(tǒng)可以進(jìn)行患者管理、冰箱管理、樣本類別管理，并可進(jìn)行使用者的權(quán)限設(shè)置，可查詢操作者的操作痕跡，數(shù)據(jù)均可自動(dòng)化備份，保證了數(shù)據(jù)的安全性。

1.4 樣本的質(zhì)量控制

樣本的質(zhì)量控制關(guān)乎整個(gè)科學(xué)研究的成敗。樣本庫的質(zhì)量管理體系，包括質(zhì)量保證和質(zhì)量控制，貫穿于樣本庫的整個(gè)運(yùn)作過程。質(zhì)量管理體系的實(shí)施和維護(hù)有助于樣本庫的長期發(fā)展，保證樣本庫為用戶提供高質(zhì)量的服務(wù)，保證科研結(jié)果的質(zhì)量，因此建立質(zhì)量管理體系具有重要意義[8]。為保證樣本質(zhì)量，在樣本的取材、運(yùn)輸、處理、取用等過程中均要根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化 SOP 的要求進(jìn)行操作。

1.5 NAFLD 生物樣本的收集流程

1.5.1 樣本采集前

1.5.1.1 提交取材申請(qǐng) 臨床醫(yī)生將取材申請(qǐng)上交至樣本庫，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批合格后方可開始收集相關(guān)樣本。臨床醫(yī)生告知樣本捐獻(xiàn)者相關(guān)事宜并與其簽署知情同意書。并尊重捐獻(xiàn)者的知情權(quán)和隱私權(quán)。

1.5.1.2 入組患者要求 為保證研究成果的質(zhì)量，對(duì)入組患者做以下要求：①年齡 18 ~ 65 歲，符合 2012 年 AASLD脂肪肝診斷標(biāo)準(zhǔn)（B 超或者腹部 CT 提示脂肪肝，無飲酒史或者折合乙醇量小于 210 g/周，其中女性< 140 g/周）；②患者無大腸癌、IBD、腹瀉等腸道疾病及自身免疫等重大基礎(chǔ)疾病；③患者無腸道手術(shù)史；入組患者一周內(nèi)不服用抗生素；④入組患者一周內(nèi)不食用辣椒、酸奶；并配以清淡飲食（不食用肥肉、雞肉等，每日以青菜、主食為主，配以少量精瘦肉）。

入組患者排除條件如下：①飲酒：近 2 年，男 > 30 g/d，女 > 20 g/d；②轉(zhuǎn)氨酶明顯升高：ALT 或 AST > 200 U/L；③伴其他肝臟疾病或肝損傷史；④嚴(yán)重心腦血管疾病或系統(tǒng)性疾病（不包括糖尿病）；⑤孕婦或備孕中。

1.5.1.3 擬定樣本取材單 參考國內(nèi)外流行病調(diào)查表設(shè)定樣本取材單，樣本取材申請(qǐng)單中應(yīng)包括患者的姓名、性別、年齡、隨訪聯(lián)系方式、飲酒史和飲酒量、油脂攝入史和攝入量，并檢測捐獻(xiàn)者身高、體重、腰圍、臀圍，由此計(jì)算出捐獻(xiàn)者體重指數(shù)[9]。同時(shí)取材單還要記錄取材樣本類型、取材量、取材者、取材時(shí)間。

1.5.2 樣本采集和處理 腸道菌群與 NAFLD 的發(fā)生和發(fā)展有著密不可分的關(guān)系，而 NAFLD 也會(huì)影響腸道菌群的定位和數(shù)量[10]。所以為滿足后續(xù)研究的需求，在收集 NAFLD 樣本時(shí)要收集血清、血漿、血細(xì)胞、腸黏膜和糞便樣本。為保證樣本質(zhì)量，在樣本取材及處理過程中要嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，嚴(yán)格控制樣本取材的時(shí)間，在保證病理診斷的基礎(chǔ)上，準(zhǔn)確取材。血液樣本處理、分裝時(shí)均在生物安全柜中的低溫操作臺(tái)上處理，做好標(biāo)記，兩人合作，盡可能縮短樣本處理的時(shí)間[4]。

1.5.2.1 腸黏膜樣本 脂肪肝患者結(jié)腸癌發(fā)生率高，建議 40 歲以上的人群常規(guī)體檢行腸鏡檢查。入組患者在做腸鏡時(shí)，樣本庫人員要到場收集捐獻(xiàn)者的腸黏膜樣本，用來檢測其腸道菌群的情況。為了保證腸黏膜的活性，用活檢鉗夾取腸黏膜樣本放入 2.0 ml 凍存管，做好標(biāo)記。迅速將其投入液氮，送回生物樣本庫并將其入庫。在患者腸道情況允許的情況下，術(shù)者在患者左半結(jié)腸鉗取 2 塊黏膜樣本，若患者腸道內(nèi)存在息肉，鉗取 2塊息肉樣本。

1.5.2.2 血液樣本 主管大夫下達(dá)醫(yī)囑，病房護(hù)士負(fù)責(zé)執(zhí)行，抽取捐獻(xiàn)者血樣。分別抽取2 ~ 3 ml 至黃管和深紫管，并將血液樣本取材單填寫完整。由院內(nèi)配送人員將血液樣本送至生物樣本庫。樣本庫工作人員在接收到樣本后負(fù)責(zé)樣本的編號(hào)、處理、信息錄入、樣本入庫等一系列工作。樣本處理步驟如下：將患者信息錄入系統(tǒng)，創(chuàng)建血清樣本 4 管，血漿樣本 4 管，血細(xì)胞 2 管，入庫至相應(yīng)位置并打印出條碼；血液樣本 3500 r/min 離心 10 min；將血清、血漿吸出各分裝在 4 個(gè) 1.5 ml 的 EP 管中；抗凝血血漿吸出后將中間白層 0.5 ml 置于 1.5 ml 的 EP 管中，取 2 管；加入1 ml RBC 裂解液，混勻，以3500 r/min離心10 min，（必要時(shí)則重復(fù)一次）；棄上清，加入 1 ml 三蒸水洗沉淀一次 3500 r/min 離心10 min；棄上清，將打印出的標(biāo)簽依次貼在相應(yīng)的樣本上；按照標(biāo)簽上的樣本位置將樣本放入對(duì)應(yīng)的冰箱中。

1.5.2.3 糞便樣本 留取患者的糞便樣本也是為了檢測患者的腸道菌群。因抗生素、益生菌及飲食對(duì)腸道菌群有影響，需按要求嚴(yán)格控制藥物及飲食。門診患者采取糞便收集盒收取糞便樣本，并由患者本人送至生物樣本庫。門診大夫負(fù)責(zé)告知患者，并發(fā)放 NAFLD 患者糞便收集告知單（圖 1）。病房患者糞便樣本收集完成后由院內(nèi)配送人員送至生物樣本庫。門診及入院患者的糞便樣本送至樣本庫后，由樣本庫工作人員統(tǒng)一入庫并貼簽放入–80 ℃超低溫冰箱。

1.5.3 樣本的質(zhì)量控制 為保證樣本質(zhì)量符合后期研究的需要，樣本庫工作人員應(yīng)定期對(duì)收集到的樣本進(jìn)行質(zhì)控。每月月底對(duì)收集到的樣本進(jìn)行盤庫，防止樣本位置錯(cuò)放、樣本標(biāo)簽漏貼、錯(cuò)貼。盤庫時(shí)采取隨機(jī)抽樣的方式，兩人合作，盤庫速度要快，嚴(yán)格杜絕樣本反復(fù)凍融。盤庫結(jié)束后修正紕漏，做出當(dāng)月盤庫報(bào)表、分析數(shù)據(jù)，若錯(cuò)誤率超過 3%，全部盤庫。

每半年隨機(jī)抽檢樣本進(jìn)行樣本質(zhì)檢。隨機(jī)抽取 8 例患者的樣本進(jìn)行質(zhì)控，血細(xì)胞提取 DNA，測濃度及260/280。腸黏膜樣本研磨后用 Trizol 法提取 RNA，并進(jìn)行 RNA 電泳分析樣本 RNA 的穩(wěn)定性。

1.6 樣本的出庫及使用

樣本使用前，申請(qǐng)使用者需向生物樣本庫提交樣本使用申請(qǐng)單，樣本使用申請(qǐng)單要寫明所需樣本的課題名稱、使用者姓名及聯(lián)系方式以及樣本具體的后續(xù)實(shí)驗(yàn)。樣本使用申請(qǐng)單經(jīng)申請(qǐng)者科室主任簽字后交由生物樣本庫，經(jīng)樣本庫組委會(huì)審批完成，樣本方可出庫。申請(qǐng)者完成實(shí)驗(yàn)后需將實(shí)驗(yàn)結(jié)果反饋給生物樣本庫，樣本庫管理員將實(shí)驗(yàn)結(jié)果錄入樣本庫質(zhì)檢系統(tǒng)中。

2 結(jié)果

北京大學(xué)人民醫(yī)院生物樣本庫自 2013 年 5 月至今收集 108 例 NAFLD 患者的腸黏膜、血液、糞便樣本，共1046 管。建庫以來，根據(jù)入組條件和入組要求，盡可能全面將非酒精性脂肪性肝病患者的樣本按照 NAFLD 樣本控制體系的要求納入樣本庫中。

非酒精性脂肪肝患者糞便收集告知單 因您參與本課題，并已簽署相應(yīng)的知情同意書。您已于 年 月 日在 XX 科就診，我們希望您在就診后的兩周不服用抗生素和益生菌；不食用辣椒、酸奶，并配以清淡飲食（不食用肥肉、雞肉等），每日以青菜、主食為主，配以少量精瘦肉。糞便標(biāo)本采集時(shí)應(yīng)挑取有膿血、黏液部分；外觀無明顯異常時(shí)，應(yīng)于糞便內(nèi)外多點(diǎn)取樣；液狀糞便取絮狀物 2 ~ 5 ml，盛于糞便收集管或無菌容器中。并在 -- 年 -- 月 -- 日使用我們發(fā)給您的糞便收集盒，收集 5 g 左右糞便（糞便收集盒一匙），在收集盒上標(biāo)上您的名字。如您是門診患者請(qǐng)?jiān)?1 ~ 2 天內(nèi)送到 ------。如您是入院患者，樣本取材完成后請(qǐng)將樣本交由病房護(hù)士。衷心感謝您的配合！

S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 2818 5

隨機(jī)抽樣 8 例患者的 16 管黏膜樣本、16 管血液樣本檢測 RNA 完整性及 DNA 純度均符合后續(xù)研究需求。血細(xì)胞提取 DNA 后用紫外分光光度計(jì)測260/280均處于 1.8 ~ 2.0 之間，表明樣本質(zhì)量較好。將黏膜樣本研磨后用 Trizol 法提取樣本總 RNA，260/280均在 1.8 ~ 2.0 之間，表明 RNA 純度較好。非變性 RNA 電泳的結(jié)果如圖 2 所示，可見明顯的 28S 和 18S，其中 2 號(hào)和 16 號(hào)樣本的 RNA 28S 條帶消失，樣本存在一定程度的降解，因此可以得出我們抽檢的 16 管腸黏膜樣本的 RNA 完整性的合格率是 87.5%，可以滿足后期的研究需求。

3 討論

近年來針對(duì) NAFLD 的研究熱度逐漸升高，患者的樣本是進(jìn)行科學(xué)研究最寶貴的資源，樣本的收集、運(yùn)輸以及保存直接關(guān)系到樣本的質(zhì)量和后期研究的成敗。隨著“十二五”科技計(jì)劃的推進(jìn)，我國生物樣本庫的建設(shè)正處于蓬勃發(fā)展中，樣本的留取和保存也越來越規(guī)范。北京大學(xué)人民醫(yī)院生物樣本庫在建庫過程中嚴(yán)格按照規(guī)范進(jìn)行，NAFLD 樣本取材、處理、入庫、質(zhì)控及出庫等各個(gè)環(huán)節(jié)中，嚴(yán)格遵守院內(nèi)建立的質(zhì)量控制體系。

為盡量避免個(gè)體差異，在患者入組前，我們?cè)O(shè)定了患者入組標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)入組的每一個(gè)患者進(jìn)行嚴(yán)格的把控。NAFLD 患者一經(jīng)確認(rèn)入組，主管大夫會(huì)和患者簽定知情同意書。生物樣本庫工作人員專門負(fù)責(zé)后期的樣本收集、處理、入庫、質(zhì)檢等相關(guān)性工作。

血液樣本由門診或者病房護(hù)士抽取，然后由專職人員送至生物樣本庫，樣本庫工作人員在 2 h 之內(nèi)分離血清、血漿、血細(xì)胞，貼上對(duì)應(yīng)的條碼放入–80 ℃超低溫冰箱中。NAFLD 患者的腸黏膜樣本尤為珍貴，一旦患者做腸鏡檢查，術(shù)者會(huì)提前電話通知生物樣本庫取材人員，取材人員備液氮罐、凍存管到內(nèi)鏡室進(jìn)行取材。在腸黏膜樣本的運(yùn)輸及凍存方法上我們進(jìn)行了多次試驗(yàn)，步驟如下：①取材后常溫運(yùn)輸?shù)綐颖編欤霂熨N簽后–80 ℃超低溫冰箱保存；②取材后液氮運(yùn)輸罐運(yùn)輸?shù)綐颖編欤霂熨N簽后–80 ℃超低溫冰箱保存；③取材后液氮運(yùn)輸罐運(yùn)輸?shù)綐颖編欤霂熨N簽后液氮箱保存。我們對(duì)以上三種方法收集和保存的腸黏膜樣本分別進(jìn)行了 Trizol 法提取 RNA，并進(jìn)行 RNA 瓊脂糖凝膠電泳。通過試驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)前兩種方法收集和保存的腸黏膜樣本 RNA 降解特別嚴(yán)重，RNA 電泳跑出的條帶彌散，無 28S 和 18S 條帶。所以為保證腸黏膜的質(zhì)量，我們將取到的腸黏膜放入 2 ml 無 RNA 酶凍存管后旋緊即刻放入液氮運(yùn)輸罐中，待樣本運(yùn)輸?shù)綐颖編旌罅⒓催M(jìn)行樣本入庫和貼簽，然后放入液氮箱長期保存，貼標(biāo)簽動(dòng)作要快，嚴(yán)格杜絕腸黏膜樣本的凍融。糞便樣本在收集過程中為保證糞便的活性，要使用 SARSTEDT 糞便采集管來收集。由樣本庫工作人員負(fù)責(zé)發(fā)放采便管，患者在按照糞便留取告知單中的注意事項(xiàng)飲食之后留取糞便并在 3 d 內(nèi)送至生物樣本庫。樣本庫工作人員收到糞便樣本后將樣本分裝在 4 個(gè)凍存管中，貼標(biāo)簽后入庫到相應(yīng)的–80 ℃超低溫冰箱中。

通過嚴(yán)格遵守樣本質(zhì)量控制體系規(guī)定的樣本取材、處理、入庫流程，樣本庫收集到的 NAFLD 樣本均符合后期研究的需求。所以說嚴(yán)格的樣本質(zhì)控對(duì)樣本質(zhì)量起到至關(guān)重要的作用。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.018

張育軍，Email：rmzxzyj@163.com

2017-06-29