人臍帶血體外擴增和臨床應用的研究進展

楚曉婷，李天宇，周新，王浩

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人臍帶血體外擴增和臨床應用的研究進展

楚曉婷，李天宇，周新，王浩

214023 無錫，江蘇希瑞干細胞技術有限公司（楚曉婷、王浩）；214023 無錫，南京醫科大學附屬無錫人民醫院/無錫市兒童醫院兒血液科（李天宇）；214023 無錫，南京醫科大學附屬無錫人民醫院血液科（周新）

1974 年人類第一次認識到臍帶血中含有造血干細胞，并在 1988 年進行了全世界首例臍帶血移植，且成功治愈了一位范可尼貧血患者[1]，證明了臍帶血移植的臨床應用潛能。至今，在全世界范圍內的臍帶血移植案例已超過 4 萬例。臍帶血作為一種新的造血干細胞移植的供體，具有來源廣泛、易于采集、對供體無傷害、HLA 配型要求低、造血干/祖細胞（HSPC）含量高等優點。而且，臍帶血的制備時間相比于從一個匹配的無關供者體內獲得造血干細胞所需的時間要短 4 ~ 5 周[2]。此外，臍帶血移植（umbilical cord blood transplantation，UCBT）后的病情復發率和移植物抗宿主病的發病率相比于其他來源的造血干細胞移植也是較低的[3-4]。

然而，UCBT 應用于臨床最大的局限就是臍帶血中可提取到的總的有核細胞（total nucleated cell，TNC）數量過少。研究表明：HLA 匹配的位點越少，需要 TNC 的量就越多。根據疾病的類型，單份充足的臍帶血數量被定義為：HLA 位點全相合需> 3 × 107TNC/kg，5 個位點相合需> 4 × 107TNC/kg，4 個位點相合則需> 5 × 107TNC/kg[5]。臍帶血中所含的有核細胞數，僅有外周血和骨髓中可用有核細胞濃度的 5% ~ 10%[6]，如若進行低數量的臍帶血移植，會引起中性粒細胞恢復延遲并增加細菌及病毒的感染風險[7-8]。而雙份臍帶血移植，雖然擴大了成人使用臍帶血進行移植的范圍，但會增加移植物抗宿主病的發病率，延長血小板恢復時間，從而引發一系列問題[9]。

因此，許多科學家致力于研究如何提高臍帶血移植的成功率。主要的研究方向有：臍帶血的體外擴增、雙份臍帶血的移植（兩份均為未擴增臍帶血或其中一份為體外擴增的臍帶血）、增加臍帶血造血干細胞向骨髓的歸巢能力等。本文依據近年來國內外研究的臍帶血體外擴增的方法、研究進展和臨床效果等進行了綜述。擴增臍帶血最直接的方法是通過體外擴增臍帶血中的造血祖細胞。臍帶血的擴增能夠使粒細胞-巨噬細胞的集落形成單位數量增加，其數量高于骨髓和外周血，且臍帶血擴增的能力也要優于骨髓和外周血。因此研究者們嘗試了很多種方法來進行臍帶血的體外擴增，例：細胞因子、小分子化合物、基因修飾、間充質干細胞共培養等。

1 單獨添加細胞因子擴增臍帶血

細胞因子是最早用來體外擴增臍帶血的，不同的細胞因子對臍帶血中 HSPC 的生長發育的作用也有所不同，雖然各類細胞因子的作用機制尚不完全明確，但目前應用最廣、效果最為確切的細胞因子主要從以下 3 個方面來調節 HSC 的生長發育：①促進 HSC 從 G0 期向 G1 期的發育；②抑制 HSC 進入G0 期；③促進 S 期 HSC 的擴增[10]。例如：干細胞因子（stem cell factor，SCF）、血小板生成素（thrombopoietin，TPO）、fms 樣酪氨酸激酶 3 的配體（fms-like tyrosine kinase 3 ligand，FLT-3L）、白介素（interleukin，IL）-3、IL-6、IL-11 和粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）等都能不同程度地誘導HSC 的增殖和分化。

目前國內外有很多科研工作者從事研究不同組合的細胞因子對人臍帶血體外擴增的效果，優化篩選臍帶血干細胞擴增的細胞因子。但到目前為止，細胞因子最佳組合及濃度都尚未有定論。許多研究僅證實了，不同的細胞因子在 HSC 擴增過程中具有協同作用[11]。臍帶血經過細胞因子的擴增，雖然有核細胞及祖細胞的數量有所增加，細胞表面表達的相關分子能夠促進細胞的歸巢作用，但細胞發生了不同程度的分化[12]。因為，HSC 在體內是依賴于局部微環境以及包括轉錄因子、細胞周期調控因子、生長因子和黏附分子在內的復雜的內部和外部信號的嚴格調控，來維持自我更新和多向分化之間的平衡[13]。因此，體外擴增很難維持 HSC 原有的干性。大部分研究實驗也證實了體外擴增的臍帶血 HSPC 長期植入能力較差，而短期內臍帶血HSPC 比例占據植入細胞的主導地位[14-15]。

早在 2003 年，杜克大學醫學中心就做過經細胞因子單獨進行擴增后的臍帶血植入血液惡性腫瘤患者體內的相關臨床試驗[16]，但其結果是令人失望的。這項研究將一份臍帶血分成了兩份，其中一份使用Aastrom Replicell 生物反應器來監控培養條件并連續灌注含有 PIXY321、GM-CSF、IL-3、EPO 和 FLT-3 配體等細胞因子的培養液進行 12 d 的擴增，使擴增后的 TNC 總量（平均擴增 2.4 倍）與未處理部分的 TNC 總量相同。但擴增部分 CD34+細胞卻比未經處理的少 50%。移植后的中性粒細胞回升所需的中位時間為 22 d，血小板達到 50 × 109/L 所需的中位時間為94 d，此結果與未經處理的臍血移植相似。所以現在很多研究人員都將細胞因子作為輔助因子進行臍帶血的擴增培養，在謀求 TNC 數量增加的同時減少對細胞干性的損傷。

2 利用特異性小分子擴增臍帶血

從目前的研究來看，用細胞因子擴增臍帶血，雖然 TNC 的總量有明顯的增加，但因擴增的同時誘導了早期祖細胞分化成歸巢能力較弱的細胞群，而使 UCBT 的成功率沒有得到提高[17-20]。所以科學家們利用一些特異性小分子來阻止臍帶血體外擴增時早期祖細胞的分化，使擴增的細胞減少分化，能夠擁有更好的骨髓歸巢能力。例如銅離子螯合劑 Copper Chelation（TEPA，StemEx）、Notch Ligand、煙酰胺（Nicotinamide）、Aryl Hydrocarbon Antagonist（StemRegenin 1，SR1）等。很多小分子擴增 HSPC 的試驗都正在進行多中心的臨床試驗，其中 StemEx 已完成 III 期試驗（表 1）。

2.1 Copper Chelator (StemEx)

四乙基五胺（TEPA）是一種銅離子螯合劑，銅離子作為多種細胞酶的輔助因子，在細胞增殖和分化過程中發揮重要作用。它不僅可以調控原始造血細胞的分化和增殖，同時能夠阻斷細胞因子誘導的早期祖細胞的分化[19-20]。最新研究也表明了，通過高親和力銅離子螯合劑 TEPA 調節銅離子濃度可延遲 HSC 分化，提高增殖活性[21]。使用含有 TEPA 和 FLT3 配體、IL-6、TPO 和 SCF 的培養基對臍帶血中純化的 CD133+細胞進行為期 3 周的擴增培養，得到的 CD34+細胞的數量能夠增加約 89 倍；同時集落形成單位數也能增加 172 倍。這說明 TEPA 對臍帶血的體外擴增具有很好的效果。Peled 等[19]為了驗證擴增培養的臍帶血的可行性和安全性，首先對清髓后的小鼠進行了移植，結果表明：擴增的細胞不僅能夠提高移植的可能性還能夠維持分化成各種造血細胞的潛能。

基于這些鼓舞人心的結果，后續在 10 個高危性惡性血液病患者體內完成了 I/II 期的臨床試驗。將每份臍帶血分成兩份，一份用于擴增，一份不作處理，先輸入未經處理的臍帶血，24 h 后再輸注擴增后的臍帶血。結果顯示：9 位有效植入者中性粒細胞和血小板的中位植入時間分別為 30 和 48 d。因為這個結果與未經處理的單份臍帶血移植的結果沒有顯著差異，所以又進行了一次大規模多中心的試驗。試驗組為 101 位患者，對其進行單份臍帶血移植；對照組為 295 位患者，對其進行了雙份臍帶血移植。單份臍帶血經過擴增后（一部分擴增，一部分不做處理），給患者灌輸的 TNC 和 CD34+細胞的中位濃度分別為 2.2 × 107和9.7 × 105/kg，中性粒細胞和血小板的中位植入時間分別為21 和 54 d（對照組為：28 和 105 d），100 d 的存活率為 84.2%（對照組為 74.6%），表明用 TEPA 聯合細胞因子進行擴增的臍帶血移植效果優于對照組[22]。

2.2 Notch Ligand

Notch 信號通路是人體內重要的轉導通路之一，它能影響細胞正常形態發生的多個過程，包括多能祖細胞的分化、細胞凋亡、細胞增殖及細胞邊界的形成；且在造血功能激活過程中也發揮重要作用，可通過與 HSPC 表面的受體 Notch1-4 結合調節其生存和增殖過程[23]。其中 CD34+細胞主要是通過 Notch 受體 Deltal1 的刺激來提高 HSPC 的擴增效率[24]。而且，在細胞因子 SCF、IL-6、IL-11 和FLT-3 配體的共同作用下細胞能夠連續擴增 8 個月而維持不分化狀態。而在 GM-CSF 和另一些細胞因子刺激下又能恢復其分化能力[25]。

因此，利用重組的 Notch 配體轉導入純化的CD34+細胞，后與細胞因子聯合培養 16 d，CD34+細胞平均擴增倍數可達 222 倍[26]。這無疑對臍血移植是非常有益的。Delaney 等[26]進行了首次臨床試驗，對 10 位患者進行了雙份臍帶血移植，未經處理的臍血（TNC 和 CD34+的中位濃度分別為：3.3 × 107/kg 和 2.4 × 105/kg）移植 4 h 后植入擴增的 CD34+細胞（TNC 和 CD34+的中位濃度分別為：4.6 × 107/kg 和 60.3 × 105/kg），結果顯示：患者的中性粒細胞和血小板的中位植入時間分別為 16 和 26 d，但在 3 個月后外周血嵌合度分析結果表明：維持造血作用的細胞大多來源于未經處理的臍帶血，擴增的臍帶血僅在移植早期起作用。

總體來說基于 Notch 信號通道擴增的臍帶血的移植相對于傳統臍帶血移植是有優勢的。且一項多中心、計劃納入 160 例患者的隨機臨床試驗正在進行，以確定 Notch 信號通路擴增臍帶血進行 UCBT 的療效（clinicaltrials.gov，臨床試驗備案代碼 NCT01175785）。

2.3 煙酰胺

煙酰胺是維他命 B3 的衍生物，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的前體和 NAD 分解酶的有效抑制劑。在細胞培養液中加入煙酰胺能夠通過調節去乙酰化酶 Sirtuin（SIRT）作用于臍帶血 HSPC 中 CD34+細胞，使其分化延遲，并促進其歸巢、植入[27]。且能保持這些細胞在體外培養時不會丟失原來的生理功能，使它們在植入患者體內后更好地發揮作用。至目前為止，采用煙酰胺擴增出來的產品Nicord 已成功完成了 I/II 期臨床試驗，于 2016 年夏天開始進行 III 期臨床，現患者招募已經完成，計劃于 2018 年 7 月完成試驗。

表 1 臍帶血體外擴增的臨床進展

Nicord 來源于單份臍帶血，包括擴增的 CD133+細胞和未經處理的 CD133–細胞。首先將單份臍帶血分成兩部分：CD133–細胞和 CD133+細胞，CD133–細胞則繼續深低溫冷凍保存；CD133+細胞則與含有 NAM 和 TPO、IL-6、FLT-3 ligand、SCF 的培養基共同擴增培養 21 d，得到 CD34+細胞大約擴增 72 倍，TNC 擴增約 486 倍。預試驗在擴增培養結束后，將 Nicord 和另一份未經處理的臍帶血一起植入預先進行清髓處理的 11 位患者體內，其中性粒細胞和血小板的中位植入時間分別為 11 和 31 d，3 年存活率為 67%，且在這 8 位患者體內 Nicord 相比于另一份未經處理的臍帶血占明顯優勢[28]。

于是，在 2014 年 GamidaCell 公司進行了 Nicord 的 I/II 期的臨床試驗，與預試驗不同的是，植入患者體內的僅為 Nicord 單份臍帶血，最終植入濃度為：TNC：3.1 × 107/kg；CD34+細胞：35.0 × 105/kg。其中性粒細胞和血小板的中位植入時間分別為 11 和 33 d，一年的完全存活率為 56%，長期植入比例為 60% ~ 80%。試驗結果表明，Nicord 與普通臍帶血移植相比在很多臨床指標上有顯著改善。例如植入成功率更高，植入的細胞可以更快生成中性粒細胞和血小板，植入細胞的有效期更長，患者因為移植手術而被感染的機會降低等[28]。

2.4 StemRegenin 1

StemRegenin 1（SR1）是一種嘧啶類衍生物，通過拮抗 AHR 信號通路調控造血干細胞的自我更新和擴增。2010 年，明尼達州的一個科研小組報道，低濃度的 SR1 可使 CD34+細胞擴增 50 多倍，具有移植能力的 HSC 擴增17 倍，極大的維持了造血干細胞的自我更新能力。且聯合 SCF、FLT-3L、TPO 及 IL-6等細胞因子一起培養擴增 CD34+細胞，能使其維持未分化狀態[29]。

隨后多項研究也驗證了 SR1 在 HSPC 擴增中的確切作用，CD34+細胞擴增效率約為 328 倍[29-30]。且利用 SR1 進行臍帶血擴增的相關臨床試驗也已經展開，兩份臍帶血同時進行移植。將一份細胞數較少的臍帶血中 CD34+細胞純化出來，用 SR1 聯合細胞因子擴增培養 15 d。CD34–細胞則繼續低溫保存，直到擴增結束后，先將未經處理的細胞量較多的臍帶血植入患者，再將擴增的細胞和 CD34–細胞一起植入患者體內，移植后 17 位患者的中位粒細胞植入時間為 15 d，血小板植入時間為 49 d，長期植入比例約為 65%。移植的效果明顯優于單獨移植未經處理的臍帶血[31]。綜合考慮，利用 SR1 擴增的臍帶血能夠有效地促進患者造血功能的恢復。因此，Wagner 等正在計劃進行單獨移植擴增后的臍帶血的相關臨床試驗。

2.5 前列腺素E2

前列腺素 E2（PGE2）是一種體內含量十分豐富的類花生酸，具有多種生理活性，對造血系統有著重要的調節作用。它能提高 HSC 在移植過程中的歸巢、存活和增殖能力，以及 HSC 的長期再植能力[32-34]。此外，PGE2 還可以增強輻射損傷后 HSC 造血系統的重建能力，維持造血系統的穩定性。由于 PGE2 的半衰期非常短（1 ~ 2 min），在體外和臨床研究中常使用 PGE2 的穩定修飾物 16,16-二甲基前列腺素 E2（dmPGE2）。

Goessling 等[35]采用斑馬魚體內實驗證明了 PGE2 和 Wnt 信號通路通過調節 β-actin 的穩定性來維持HSC 的穩態，調節胚胎發育期的細胞凋亡和生長。靈長類動物移植實驗證明，在骨髓受到損傷后，PGE2 可促進 HSC 的重建，加速造血系統的恢復。PGE2 預處理后的 HSC 移植已經在靈長類動物中證明是安全的。Cutler 等[36]在 I 期臨床試驗中的結果也證實了，用 dmPGE2 對臍血 CD34+細胞進行預處理再移植，其安全性是可以保障的，并且能夠加快中性粒細胞的植入時間。

2.6 UM171

Fares 等[37]在對 5000 多種化合物進行篩選后，發現了一族小分子，可用于臍帶血干細胞的體外增殖。UM171 是一個合成的 UM729 的類似物。UM729 能夠增加人的 CD34+CD45RA–外周血細胞，但UM171 的擴增能力是 UM729 的 10 ~ 20 倍。

據報道：UM171 是一類標準的 AHR 的抑制劑，與 SR1 具有協同作用，可以增加短期造血祖細胞的擴增，而 UM171 自身也可以選擇性地提高長期造血干細胞的再生能力。試驗顯示：將 UM171 或 DMSO 處理的 CD34+CB 細胞注射到 NSG 小鼠中，在約 300 只小鼠中評估人細胞的植入水平，并以熱圖的形式表示。數據分析表明：UM171 在淋巴缺陷分化中起重要作用。且 UM171 對長期造血干細胞的影響在移植后 30 周仍然存在，在高細胞劑量時其多向貢獻明顯。UM171 不僅對體外擴增臍帶血細胞數量有明顯作用，還能大大減少與干細胞相關的并發癥[37]。所以，UM171 會是 HSPC 移植治療中的有利候補物質。

3 與間充質干細胞共培養擴增臍帶血

干細胞微環境是干細胞生長的微環境，其在維持 HSC 自我更新及多向分化中發揮重要作用[38]。而通過模擬造血微環境促進 HSC 的體外擴增技術也日益成熟。MSC 對 HSC 就擁有重要的造血支持作用[39]，主要因為：MSC 能夠提供多種體外擴增的信號通路，這些信號通路在基于單獨利用細胞因子來進行 HPC 懸浮培養中是沒有的。MSC 可通過直接接觸或分泌內源性細胞因子等方式調控 HSC。而且，利用 MSC滋養層培養擴增 HSPC 可避免 CD34 及 CD133 分選造成的細胞數的減少。

3.1 骨髓間充質干細胞

利用骨髓間充質干細胞（BM-MSC）作為飼養層擴增臍帶血已經完成了 I/II 期的臨床試驗[40]，該試驗將臍帶血與貼壁的BM-MSC、造血相關細胞因子共培養 7 d，然后單獨使用細胞因子再擴增培養 7 d。最終實現臍帶血 HSPC中CD34+細胞數目中位值增長為原有細胞中位數目的30 倍。該體外擴增培養所得的臍帶血應用于雙份 UCBT，未經操作的臍血復蘇清洗后靜脈注射，然后再注射擴增的臍血，注射后的第一天開始每天用粒細胞集落刺激因子注射至中性粒細胞恢復。

試驗表明，患者中性粒細胞的植入時間為 15 d，血小板的中位植入時間為 42 d。約 50%的患者在UCBT 后3 ~ 4 周呈現混合性嵌合狀態，但長期植入（> 12 個月）的臍帶血 HSPC 主要來源于未擴增的那一份臍帶血。可能原因是培養的過程中耗盡了細胞長期增殖的能力。與未經處理的臍帶血相比，用 MSC 擴增的臍血增加了單核細胞和粒細胞的比例，但是減少了 T、B 細胞的比例。但總的來說，利用 MSC 共培養技術來擴增臍帶血是可行的，能夠明顯縮短細胞植入時間，提高成功率。

3.2 與球狀體 BM-MSC 共培養

Futrega 等[41]利用高通量聚二甲硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）微孔適當地改善了體外 HSPC 的擴增。PDMS 微孔的作用是使 MSC 成球形，提供一個三維的培養體系。接種前先在微孔表面預涂 5% 的普朗尼克（pluronic F127）以防止 MSC 貼壁，接種后離心使細胞聚合，在微孔中形成球形，再接入 CD34+細胞進行共培養。這種球狀三維的共培養體系擴增出的 CD34+細胞的數量與二維單層細胞共培養并無明顯區別，但 CD34+CD38–的細胞數量卻遠超二維培養體系。甚至他們發現在沒有 MSC 的情況下，僅使用 PDMS 微孔進行培養時 CD34+CD38–的細胞數量也會增加。但是這些三維體系擴增的細胞在動物實驗上并沒有增加其移植成功率，僅與利用單層 MSC 作為飼養層來擴增的臍帶血的移植率相似。總的來說，雖然球形 MSC 共培養并沒有解決 CD34+細胞擴增培養過程中長期植入能力的消耗問題，但卻發現了 PDMS 微孔對 CD34+細胞擴增具有一定作用。

3.3 臍帶華通氏膠間充質干細胞

新加坡的一個項目研究組針對采用臍帶華通氏膠培養出來的 MSC 單層細胞作為飼養層進行擴增臍帶血的效果做了大量研究[42]。研究表明，臍帶華通氏膠間充質干細胞（UCWJ-MSC）與成人的 BM-MSC 相比具有直接可用、供者痛苦少、病毒感染率低等優點，且具有更好的擴增能力，耗時也會較短。表達的與臍血擴增相關的標志物和分子也比 BM-MSC 多，這些分子都在臍血擴增中起重要作用。不僅是 WJ-MSC 能夠起到擴增培養臍帶血的作用，單獨使用其培養液也能對臍帶血擴增起到一定作用[43]。但目前這項研究還沒有正式進入臨床試驗。

Fong 等[44]做了相關的臨床預試驗，結果表明同時灌注 UCWJ-MSC 和 UCB-HS/PC 能夠提高造血細胞移植成功率。UCWJ-MSC 和沒有經過處理的 UCB 一起灌注，比單獨灌注沒有處理過的 UCB，粒細胞和血小板的回升天數要短。

4 與成骨細胞共培養擴增臍帶血

近年來相關研究證實：成骨細胞是構建造血生態位區至關重要的支撐部分，并對其中的 HSPC 發育、增殖和分化及成熟等生理活動發揮著關鍵的調控作用[45-46]。有研究認為成骨細胞與 HSPC 直接接觸對于CD34+細胞有數量上的維持；成骨細胞也可以通過分泌各種細胞因子來刺激造血細胞擴增和干細胞特性的維持[47]。

最新研究發現，成骨細胞分泌的胞外囊泡中含有許多的生物活性物質，可以調節造血干細胞的生長。特別是胞外囊泡中存在的 miRNA，如：miR-21-5p、miR-100-5p 和 let-3 家族。其中 miRNA-29a 對于HSPC 的增殖、凋亡、細胞周期和細胞外基質黏附都有影響。Morhayim 等[48]將成骨細胞胞外囊泡、臍帶血CD34+細胞與細胞因子一起培養擴增 10 d 后，TNC 總量和 CD34+細胞總量都有明顯增加，集落形成單位 CFU 數量相較于對照組也增加了 10% ~ 45%。將數量相等的擴增后的細胞和未經處理的細胞分別植入 NSC 小鼠體內，分別在 19 周和 21 周后對其外周血和骨髓中的細胞做了流式分析，結果表明，經過成骨細胞胞外囊泡共同培養的 CD34+細胞能夠成功進行移植和重建小鼠的造血功能，其效果和對照組無明顯差別。

5 與內皮祖細胞共培養擴增臍帶血

在主動脈性腺中腎區，HSPC 與內皮細胞位置相近，且在胚胎發育過程中，造血細胞和內皮細胞是來源于同一前體細胞的[49]，這就說明了內皮祖細胞和 HSPC 也有著緊密的聯系。在 BM 微環境中，兩者的相互作用有助于 HSPC 的自我更新和分化[50-51]。Qu 等[52]將臍帶血中的內皮祖細胞分離培養后，作為滋養層細胞體外擴增 HSPC。實驗表明：EPCs 通過產生多種生長因子和通路分子來為 HSPC 的體外擴增提供合適的微環境。例如：EPCs 能夠高表達造血相關因子 IL-6 和 ANGPT1，且在 EPCs與 HSPC 共培養時 WNT5A 基因會出現高水平的轉錄，能夠激活 wnt 信號通路。

EPCs 作為滋養層與 HSPC 直接接觸共培養 7 d，CD34+細胞擴增約為 5.38 倍，CD34+CD38–細胞則擴增了約 156.17 倍。而單獨用細胞因子培養的對照組，CD34+細胞擴增了（3.25 ± 0.59）倍，而 CD34+CD38–細胞僅擴增了約 79 倍。將擴增后的 HSPC 和未經處理的 HSPC 以相同細胞數分別植入到免疫缺陷的非肥胖糖尿病小鼠體內，8 周后檢測小鼠骨髓中人 CD45 細胞的比率，結果顯示其百分比分別為：（13.3 ± 11.0）% 和（16.0 ± 14.3）%[52]。此結果可以說明 EPCs 共培養也是體外擴增 HSPC 的一種有效方法，但要運用到臨床還需要做更深入的研究。

6 應激誘導的臍帶血的體外擴增

6.1 p38α

p38MAPK 通路在造血細胞調節過程中占重要地位，抑制 p38MAPK 通路可一定程度緩解造血干細胞功能下降[53]。來自日本的科學家們發現在骨髓移植等應激情況下，造血干細胞和祖細胞內的p38MAPK 能夠激活嘌呤代謝推動細胞進入細胞周期促進細胞增殖，從而對應激產生應答反應[54]。

報告稱，p38MAPK 家族中的一個成員 p38α 在小鼠應激造血過程中啟動造血干細胞和祖細胞（HSPC）的增殖方面發揮重要作用。在受到應激后，HSPC 中的 p38MAPK 會立即被磷酸化，促進 HSPC 進入細胞周期。p38α 信號途徑能夠增加 HSPC 中一種叫做肌苷-5'-單磷酸脫氫酶 2（IMPDH2）的分子的表達，導致氨基酸和嘌呤相關代謝物水平發生變化，同時還會在體內和體外情況下改變細胞周期進展。而條件敲除 p38α 會導致應激造血過程的損傷，造成 HSPC 增殖啟動被延誤[54]。這項研究解釋了 p38α 介導的信號途徑改變 HSPC 代謝從而產生應激應答促進細胞周期恢復的機制，這對于應用造血干細胞進行血液疾病治療，或者可以通過這種機制進行造血干細胞擴增有重要意義。

6.2 低氧應激

造血干細胞在體內所處的位置都屬于低氧環境。然而，到目前為止，許多造血干細胞研究結果都是基于非生理條件下的氧分壓，即常氧。但在常氧下培養易導致細胞的氧化損傷，低氧對維持造血干細胞干性具有重要作用。在不同氧濃度下，造血干細胞具有不同的增殖潛能、周期分布和存活能力。

目前，就低氧環境對造血干細胞擴增的研究主要集中于影響其擴增的機制，主要是通過 HIF 信號通路和活性氧刺激來進行。低氧能阻止已經在 G0 期的細胞退出周期，還能使處在周期中的細胞進入靜息，這兩種途徑會增加 G0 期的細胞數[55-56]，從而維持細胞的干性。最新研究成果也發現，在低氧環境（3% O2）或添加環孢霉素 A 可作用于線粒體通透性轉換孔，增加 HSPC 的收集量[57-58]。

但是什么樣的低氧濃度和低氧作用時間對于臍帶血的擴增和細胞周期的靜止最有利還沒有定論，且其相關的機制還需進一步的研究，但低氧對細胞擴增的優勢是毋庸置疑的。

7 利用基因修飾技術擴增臍帶血

隨著對細胞信號轉導途徑及其機制的認識，研究者們可以利用基因修飾技術，控制細胞增殖分化以獲得我們所需要的細胞類型。

HoxB4 為同源盒基因家族的一個成員，在早期造血細胞中高表達，隨著 HSC 的分化，其表達逐漸下降直至消失。研究者嘗試用轉導 HoxB4 基因的 MSC 聯合細胞因子來體外擴增臍血 CD34+細胞[59-60]。結果可以更加有效地體外擴增臍血 CD34+細胞，這也可能與 HoxB4 對維持 HSC 自我更新等干細胞特性的功能有關。此外，Amsellem 等[61]將 HoxB4 導入 MS-5 細胞株，用這種細胞株作為臍帶血的飼養層細胞，獲得的結果也是類似的。

JAK2 在造血干細胞的自我更新中起著重要作用，SCF、FLT 和 G-CSF 等大多數細胞因子是通過 JAK2 來傳遞信號的。通過構建一個含有 JAK2 的逆轉錄病毒載體將該載體轉入 HSPC。通過給予小分子靶向基因合成藥物 AP20187 來誘導 JAK2 二聚化[62]。JAK2 激活后能夠啟動細胞內信號來實現臍帶血干細胞的大量擴增與調控。

miR-17 在造血系統中也起著重要的調節作用，在人造血細胞開始分化時它的表達水平會下調。Yang 等[63]通過構建載體將 miR-17 的基因片段轉染至人臍帶血 CD34+細胞中，使其在細胞中大量表達。這些細胞經與細胞因子共同培養后，CD34+細胞有明顯增加，相反若 miR-17 表達受限的話 CD34+細胞則會減少。實驗表明：雖然擴增后的 CD34+細胞在體內的造血重建能力降低，但它能夠分泌黏附因子，使 CD34+細胞黏附到其生態位區。因此，可以說 miR-17 在造血系統發育中起著關鍵的調節作用。這對今后研究細胞信號轉導及開展干細胞和基因治療都有潛在應用價值。

8 總結

近年來，大量的臍帶血體外擴增體系已經建立起來，多個獨立的相關臨床試驗均取得了較好的結果。在現行的體外擴增技術中，細胞因子仍是重要工具，上述方法中無論哪種都會運用到細胞因子的幾種組合來進行輔助性的擴增培養。但由于多因素的影響以及體內造血微環境的復雜性之間的相互作用，擴增效果與體外擴增的條件之間沒有明確的定量關系，也沒有一個標準化的方案來實現最佳擴增。但是隨著技術的迅速進步，相信未來的 HSPC 的體外擴增技術在解決臍帶血的數量問題上將有重大的發展前景。而一旦臍帶血擴增問題得到解決，臍帶血在醫療中的應用價值將會更加巨大。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.010

無錫市科技發展資金（CBE01G1603）；江蘇省科教強衛創新團隊（CXTDB2017016）；無錫市科教強衛發展學科（FZXK001）；無錫市衛生局重大項目（Z201302）

王浩，Email：wanghao@cruilife.com

2017-08-04