采用細(xì)胞質(zhì)特異性定位的熒光探針觀察細(xì)胞多核化現(xiàn)象

吳峰，劉建彬，胡澤斌

?

采用細(xì)胞質(zhì)特異性定位的熒光探針觀察細(xì)胞多核化現(xiàn)象

吳峰，劉建彬，胡澤斌

100142 北京，空軍航空醫(yī)學(xué)研究所（吳峰）；100142 北京，空軍總醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心（劉建彬）；100050 北京，中國(guó)食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所（胡澤斌）

細(xì)胞多核化是指一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中同時(shí)存在兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞核[1-5]。細(xì)胞多核化現(xiàn)象的產(chǎn)生通常是由于處于基因組復(fù)制中的細(xì)胞，其染色體運(yùn)動(dòng)發(fā)生異常，形成了不同大小的細(xì)胞核。這些大小不一的細(xì)胞核均被核膜包裹，對(duì)于比較小的細(xì)胞核，通常稱為微核或核片段。細(xì)胞多核化現(xiàn)象既存在于病理狀態(tài)的細(xì)胞，也可以存在于生理狀態(tài)的細(xì)胞中。研究發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞多核化現(xiàn)象與多種疾病相關(guān)。病理檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)多核化的巨型細(xì)胞的存在與慢性炎癥有關(guān)[6-7]。另外，細(xì)胞多核化提示細(xì)胞染色體的不穩(wěn)定，所以細(xì)胞多核化現(xiàn)象也頻繁出現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中[8-9]。

目前細(xì)胞多核化現(xiàn)象的評(píng)估主要是采用細(xì)胞核染色的方法[1-2, 5]。對(duì)于固定好的細(xì)胞，細(xì)胞核染料，如吉姆薩、蘇木精，可以將細(xì)胞核染色，細(xì)胞質(zhì)基本沒(méi)有著色，從而可以觀察到細(xì)胞質(zhì)中是否存在多個(gè)細(xì)胞核的現(xiàn)象。但是，這種方法觀察到的細(xì)胞邊緣往往模糊不清，難以判斷幾個(gè)細(xì)胞核是位于同一個(gè)細(xì)胞還是相鄰細(xì)胞中。對(duì)于活細(xì)胞中多核化現(xiàn)象的觀察，則通常采用細(xì)胞核熒光染料，如 DAPI、Hoechst，將活細(xì)胞細(xì)胞核染色。通過(guò)細(xì)胞核熒光染色的圖片與明場(chǎng)中的細(xì)胞圖像進(jìn)行疊加，可以確定多個(gè)細(xì)胞核是否位于一個(gè)細(xì)胞內(nèi)。缺點(diǎn)同樣是明場(chǎng)中細(xì)胞的邊界不是很清楚，邊緣難以判斷[9]。

細(xì)胞質(zhì)特異性定位的熒光探針（cytoplasm localized fluorescent probe，CLFP）是指一類能夠特異性聚積在活細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的熒光染料[1, 10-15]。將活細(xì)胞與 CLFP 探針進(jìn)行孵育，在熒光顯微鏡下能夠清晰地觀察到細(xì)胞質(zhì)的熒光形態(tài)以及細(xì)胞質(zhì)的邊緣形態(tài)。近年來(lái)，CLFP 探針已經(jīng)被逐步地應(yīng)用于各種細(xì)胞成像研究中。本研究中，我們根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)合成新的 CLFP 探針，并且建立了通過(guò)熒光影像方法區(qū)分細(xì)胞多核化現(xiàn)象。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

色譜用層析硅膠為青島海洋化工廠產(chǎn)品，其余化學(xué)試劑和溶劑購(gòu)自北京偶合科技有限公司和北京伊諾凱科技有限公司，均為市售分析純產(chǎn)品。核磁共振儀為 Bruker AVANCEIII 400，中壓純化色譜儀為 Biotage Isolera One，高分辨質(zhì)譜儀為 Thermo Exactive Orbitrap plus。細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自昆山一恒儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CLFP 探針的化學(xué)合成 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，我們采用常用的熒光母核 Boron-dipyrromethene（BODIPY）設(shè)計(jì)了一系列細(xì)胞質(zhì)特異性定位的熒光探針，其合成路線如圖 1 所示[1, 16-18]。

1.2.1.1 中間體 3 的合成 2,4-二甲基吡咯 1（200 mg，2.1 mmol）被 30 ml 無(wú)水二氯甲烷溶解后，加入 4-氯甲基苯甲酰氯 2（200 mg，1.05 mmol），在氬氣保護(hù)下室溫?cái)嚢?0 min，之后加熱至 50 ℃攪拌 2 h。冷卻后真空蒸餾出大部分溶劑，向母液中加入 30 ml 無(wú)水甲苯和 5 ml 無(wú)水二氯甲烷，室溫?cái)嚢?10 min 后，加入三乙胺（505 mg，5 mmol）和三氟化硼乙醚溶液（760 mg，5 mmol），之后加熱至 50 ℃攪拌 2 h。反應(yīng)結(jié)束后，真空蒸餾出大部分溶劑，加入乙酸乙酯 300 ml，再用飽和 NaCl 溶液洗至中性，有機(jī)相用無(wú)水 Na2SO4進(jìn)行干燥。之后通過(guò)中壓純化色譜儀分離出70 mg 中間體 3，收率 18%。

1 2 3 4 5

1.2.1.2 CLFP-1 的合成 將中間體 3（50 mg，0.13 mmol），Cs2CO3（87 mg，0.26 mmol）和 KI（45 mg，0.26 mmol）溶解于 30 ml 無(wú)水乙腈中，再加入正丁胺（95 mg，1.3 mmol），氬氣保護(hù)下室溫?cái)嚢?10 min，再升溫至 80 ℃攪拌 2 h。反應(yīng)結(jié)束后，真空蒸餾出大部分溶劑，加入乙酸乙酯 200 ml，再用飽和 NaCl 溶液洗至中性，有機(jī)相用無(wú)水 Na2SO4進(jìn)行干燥，之后通過(guò)中壓純化色譜儀分離出目標(biāo)化合物。最后將產(chǎn)物經(jīng)過(guò)氯化氫的二氯甲烷溶液制備成鹽酸鹽，得到 30 mg CLFP-1，收率 57%。

1.2.1.3 CLFP-2 的合成 將中間體 3（50 mg，0.13 mmol），Cs2CO3（87 mg，0.26 mmol）和 KI（45 mg，0.26 mmol）溶解于 30 ml 無(wú)水乙腈中，再加入戊胺（113 mg，1.3 mmol），氬氣保護(hù)下室溫?cái)嚢?10 min，再升溫至 80 ℃攪拌 2 h。反應(yīng)結(jié)束后，真空蒸餾出大部分溶劑，加入乙酸乙酯 200 ml，再用飽和 NaCl 溶液洗至中性，有機(jī)相用無(wú)水 Na2SO4進(jìn)行干燥，之后通過(guò)中壓純化色譜儀分離出目標(biāo)化合物。最后將產(chǎn)物經(jīng)過(guò)氯化氫的二氯甲烷溶液制備成鹽酸鹽，得到 48 mg CLFP-2，收率 80%。

1.2.2 CLFP 探針的細(xì)胞定位研究 將 HepG2 細(xì)胞接種于 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞覆蓋了培養(yǎng)板的 50%。將上述合成的探針加入到培養(yǎng)基中至終濃度為 1.0 μmol/L。在 37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育大約 20 min 后，用 PBS 緩沖液清洗沒(méi)有吸收的熒光探針。在熒光顯微鏡下，采用藍(lán)光激發(fā)，觀察細(xì)胞中的綠色熒光。

1.2.3 多核化細(xì)胞模型的構(gòu)建 將HepG2 細(xì)胞接種于 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞覆蓋了培養(yǎng)板的 70%，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入 0.5 μmol/L 的紫杉醇，孵育過(guò)夜之后，即可以得到細(xì)胞多核化或細(xì)胞核片段化模型。

1.2.4 CLFP 探針觀察多核化細(xì)胞模型的方法 將 CLFP 熒光探針加入含有多核化細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中至終濃度為 1 μmol/L，孵育 20 min。采用 PBS 緩沖液清洗培養(yǎng)基中沒(méi)有吸收的染料，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞多核化現(xiàn)象。

2 結(jié)果

2.1 CLFP 熒光探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定

基于熒光母核 BODIPY，我們?cè)O(shè)計(jì)合成了兩個(gè) CLFP 熒光探針，分別為CLFP-1（圖 2）和CLFP-2（圖 3）并且對(duì)其進(jìn)行核磁共振（NMR）鑒定和高分辨質(zhì)譜（HRMS）分析。

圖 2 熒光探針CLFP-1

圖 3 熒光探針CLFP-2

2.1.1 CLFP-1 的圖譜信息1H-NMR（400MHz，CDCl3）：= 0.91（t，3H），1.21（m，2H），1.41（s，6H），1.71（m，2H），2.45（s，6H），3.05（t，2H），4.30（s，2H），6.05（s，2H），7.42（d，= 8.0Hz，2H）7.68（d，= 8.0Hz，2H）。

13C-NMR（101MHz，CDCl3）：= 12.40，13.12（2C），13.15（2C），19.44，27.63，50.34，60.08，120.99（2C），128.90（2C），130.78（2C），130.80，132.40（2C），136.23（2C），140.85，142.88，155.62（2C）。

HRMS（ESI）：m/z [M + H] 計(jì)算所得 C25H31N3BF2：410.25806；檢測(cè)得到：410.25736。

2.1.2 CLFP-2 的圖譜信息1H-NMR（400 MHz，CDCl3）：= 0.87（t，3H），1.29（br，10H），1.90（br，2H），2.55（br，6H），2.76（br，2H），4.29（br，2H），5.98（s，2H），7.39（d，= 8.0Hz，2H），7.82（d，= 8.0Hz，2H），10.10（br，NH-HCl，2H）。

13C-NMR（101 MHz，CDCl3）：= 13.82，14.48，14.62，21.95，25.53，28.80，45.44（2C），49.87（2C），121.50（2C），129.21（2C），130.95（2C），131.06，131.16，136.56（2C），140.20，142.66（2C），155.95（2C）。

HRMS（ESI）：m/z [M + H] 計(jì)算所得C25H33N3BF2：424.27301；檢測(cè)得到：424.27234。

2.2 CLFP 熒光探針在 HepG2 細(xì)胞中的定位

將兩個(gè) CLFP 熒光探針（CLFP-1，CLFP-2）與培養(yǎng)的 HepG2 細(xì)胞進(jìn)行共同孵育。熒光顯微鏡下觀察到兩個(gè)熒光探針均為細(xì)胞質(zhì)特異性定位的探針，圖像邊緣清晰，對(duì)比度高，熒光強(qiáng)度適中（圖 4）。我們?cè)?BODIPY 熒光母核上增加脂溶性的基團(tuán)所生成的 CLFP 探針更加有利于進(jìn)入活細(xì)胞，并且成功地定位于細(xì)胞質(zhì)中，而不進(jìn)入細(xì)胞核中。由于兩個(gè)探針在結(jié)構(gòu)上非常相似（僅側(cè)鏈有 1 個(gè) CH2的差別），所以在細(xì)胞影像圖像的清晰度和對(duì)比度上沒(méi)有明顯的差別。

圖 4 熒光探針 CLFP-1（A）和CLFP-2（B）在 HepG2 細(xì)胞中的定位（兩個(gè)熒光探針均為細(xì)胞質(zhì)特異性定位熒光探針，且能夠提供清晰的熒光圖像）

圖 5 CLFP-1（A）和 CLFP-2（B）熒光探針顯示紫杉醇處理的具有細(xì)胞多核化及細(xì)胞核片段化特征的 HepG2 細(xì)胞

圖 6 Hoechst 染色紫杉醇處理的具有細(xì)胞多核化及細(xì)胞核片段化特征的 HepG2 細(xì)胞（A：Hoechst 染色；B：可見(jiàn)光區(qū)域；C：圖像疊加；圖中箭頭標(biāo)示了一個(gè)多核化的細(xì)胞，但是這個(gè)細(xì)胞與其相鄰細(xì)胞的邊緣在明場(chǎng)照片中不是很清楚，合理評(píng)價(jià)細(xì)胞多核化受到影響）

2.3 CLFP 熒光探針呈現(xiàn)細(xì)胞多核化及細(xì)胞核片段化

CLFP-1，CLFP-2 均為較好的細(xì)胞質(zhì)特異性定位熒光染料，能夠特異性地定位于活細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。接下來(lái)，我們采用 0.5 μmol/L 紫杉醇過(guò)夜處理了 HepG2 細(xì)胞，細(xì)胞的染色質(zhì)在遷移的過(guò)程中受到了紫杉醇的抑制，抑制了 HepG2 細(xì)胞核的正常分裂，從而制備了經(jīng)典的細(xì)胞多核化及細(xì)胞片段化的模型。經(jīng)過(guò)熒光染料 CLFP 的染色，由于細(xì)胞核部分不發(fā)生熒光染色，顯示為黑色的孔洞（圖 5），所以，我們可以清楚地看到細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞核數(shù)目。

同樣，我們采用傳統(tǒng)的細(xì)胞核染料 Hoechst 對(duì)經(jīng)0.5 μmol/L 紫杉醇處理的多核化 HepG2 細(xì)胞進(jìn)行染色。我們同時(shí)進(jìn)行可見(jiàn)光的圖像拍攝以及細(xì)胞核圖像的拍攝，將兩者進(jìn)行疊加，可以觀察到細(xì)胞多核化的現(xiàn)象（圖 6）。但是，傳統(tǒng)的方法，由于各個(gè)小細(xì)胞核片段具有熒光強(qiáng)度，在進(jìn)行圖像記錄時(shí)，會(huì)互相影響小細(xì)胞核的邊緣。另外，明場(chǎng)圖像無(wú)法清晰地區(qū)分細(xì)胞核的邊緣，對(duì)于細(xì)胞核片段的計(jì)數(shù)存在一定的缺陷。

3 討論

異常的細(xì)胞分裂或融合會(huì)產(chǎn)生多核細(xì)胞，以及任何阻斷細(xì)胞分裂進(jìn)程的相關(guān)因素都可誘導(dǎo)細(xì)胞多核化，細(xì)胞多核化現(xiàn)象廣泛地存在于生物醫(yī)學(xué)研究中。然而，對(duì)于這一現(xiàn)象呈現(xiàn)與評(píng)估目前不是非常的方便，傳統(tǒng)的評(píng)估方法是通過(guò)進(jìn)行細(xì)胞核染色來(lái)確定細(xì)胞核是否存在于一個(gè)細(xì)胞中。不僅操作不方便，而且由于多核化細(xì)胞通常表現(xiàn)出細(xì)胞肥大的現(xiàn)象，且細(xì)胞邊緣不易界定。這些都局限了傳統(tǒng)細(xì)胞核染色來(lái)觀察細(xì)胞多核化。發(fā)展新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)來(lái)有效地評(píng)估細(xì)胞多核化非常有意義。

另外一方面，熒光探針已經(jīng)可以特異性地染色活細(xì)胞中特定細(xì)胞器。CLFP 是一種特異性染色細(xì)胞質(zhì)的熒光探針。CLFP 在各種細(xì)胞中的分布情況以及其光物理學(xué)的特性也已經(jīng)有所報(bào)道了。運(yùn)用 CLFP 進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)染色，從而襯托細(xì)胞核的形狀，用來(lái)研究細(xì)胞的多核化。這一方法的特點(diǎn)如下：

⑴ CLFP 方法操作簡(jiǎn)單，只需要進(jìn)行探針與觀察細(xì)胞共同孵育 20 min 左右，在熒光顯微鏡下即可觀察。

⑵ CLFP 方法能夠清晰顯示各個(gè)細(xì)胞核的形狀，尤其可以顯現(xiàn)出細(xì)胞的輪廓。這就使得對(duì)于評(píng)估多個(gè)細(xì)胞核是否位于一個(gè)細(xì)胞內(nèi)非常簡(jiǎn)便。

因此，CLFP 方法評(píng)估細(xì)胞多核化現(xiàn)象簡(jiǎn)便易行，圖像分辨清晰，是生物醫(yī)學(xué)研究細(xì)胞多核化現(xiàn)象的一個(gè)有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法。

[1] Wen H, Cui Q, Meng H, et al. A high-resolution method to assess cell multinucleation with cytoplasm-localized fluorescent probes. Analyst, 2016, 141(13):4010-4013.

[2] Yu Y, Duan J, Geng W, et al. Aberrant cytokinesis and cell fusion result in multinucleation in HepG2 cells exposed to silica nanoparticles. Chem Res Toxicol, 2015, 28(3):490-500.

[3] Yoshida K, Obata S, Ono M, et al. TPA-induced multinucleation of a mesenchymal stem cell-like clone is mediated primarily by karyokinesis without cytokinesis, although cell-cell fusion also occurs. Eur J Cell Biol, 2007, 86(8):461-471.

[4] Shekhar MP, Lyakhovich A, Visscher DW, et al. Rad6 overexpression induces multinucleation, centrosome amplification, abnormal mitosis, aneuploidy, and transformation. Cancer Res, 2002, 62(7):2115-2124.

[5] Mukherjee A, Misra S, Howlett NG, et al. Multinucleation regulated by the Akt/PTEN signaling pathway is a survival strategy for HepG2 cells. Mutat Res, 2013, 755(2):135-140.

[6] Dean P, Kenny B. A bacterial encoded protein induces extreme multinucleation and cell-cell internalization in intestinal cells. Tissue Barriers, 2013, 1(1):e22639.

[7] Brown HM, Knowlton AE, Snavely E, et al. Multinucleation during C. trachomatis infections is caused by the contribution of two effector pathways. PLoS one, 2014, 9(6):e100763.

[8] Lewis JS Jr, Scantlebury JB, Luo J, et al. Tumor cell anaplasia and multinucleation are predictors of disease recurrence in oropharyngeal squamous cell carcinoma, including among just the human papillomavirus-related cancers. Am J Surg Pathol, 2012, 36(7):1036- 1046.

[9] Alvarez JV, Pan TC, Ruth J, et al. Par-4 downregulation promotes breast cancer recurrence by preventing multinucleation following targeted therapy. Cancer Cell, 2013, 24(1):30-44.

[10] Cunningham CW, Mukhopadhyay A, Lushington GH, et al. Uptake, distribution and diffusivity of reactive fluorophores in cells: implications toward target identification. Mol Pharm, 2010, 7(4): 1301-1310.

[11] Kowada T, Maeda H, Kikuchi K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chem Soc Rev, 2015, 44(14):4953-4972.

[12] Yun SW, Kang NY, Park SJ, et al. Diversity oriented fluorescence library approach (DOFLA) for live cell imaging probe development. Acc Chem Res, 2014, 47(4):1277-1286.

[13] Sinkeldam RW, Greco NJ, Tor Y. Fluorescent analogs of biomolecular building blocks: design, properties, and applications. Chem Rev, 2010, 110(5):2579-2619.

[14] Lee JS, Kang NY, Kim YK, et al. Synthesis of a BODIPY library and its application to the development of live cell glucagon imaging probe. J Am Chem Soc, 2009, 131(29):10077-10082.

[15] Gon?alves MS. Fluorescent labeling of biomolecules with organic probes. Chem Rev, 2009, 109(1):190-212.

[16] Michel BW, Lippert AR, Chang CJ. A reaction-based fluorescent probe for selective imaging of carbon monoxide in living cells using a palladium-mediated carbonylation. J Am Chem Soc, 2012, 134(38): 15668-15671.

[17] Benniston AC, Copley G. Lighting the way ahead with boron dipyrromethene (Bodipy) dyes. Phys Chem Chem Phys, 2009, 11(21): 4124-4131.

[18] Kim E, Koh M, Ryu J, et al. Combinatorial discovery of full-color-tunable emissive fluorescent probes using a single core skeleton, 1,2-dihydropyrrolo[3,4-beta]indolizin-3-one. J Am Chem Soc, 2008, 130(37):12206-12207.

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.013

國(guó)家自然科學(xué)基金（81472396）

胡澤斌，Email：huzbcmba@163.com

2017-06-06