補體分子C1q免疫透射比濁法試劑的性能驗證

黃立綱，周瑋，閃全忠

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補體分子C1q免疫透射比濁法試劑的性能驗證

黃立綱，周瑋，閃全忠

100016 北京，清華大學第一附屬醫院檢驗科

C1q 是補體 C1 的重要組成部分，是補體系統經典途徑的重要識別分子，能夠啟動經典途徑，并且在固有免疫和特異性免疫之間發揮主要的連接作用。最近的研究發現，C1q 能增強多種吞噬細胞的吞噬功能，例如增強對于細菌、免疫復合物、凋亡細胞、損傷的脂蛋白等的吞噬清除。此外，C1q 也可以調節白細胞炎癥反應和信號傳導[1]。C1q 在清除凋亡細胞的過程中，有著重要的防御自身抗體產生及免疫自穩的作用[2]。當 C1q 缺失、消耗過多或功能低下，會誘發腎病、動脈粥樣硬化、中樞神經系統疾病的發生發展，而且 C1q 與衰老相關。因此，監測血清 C1q 水平變化有助于疾病的早發現、早治療，可作為疾病療效評估和預后觀察的有效指標[3]。

將補體 C1q 免疫透射比濁法試劑，安裝在全自動生化分析儀，對患者標本進行檢測，可以提高工作效率，減少患者等候時間。本文的研究目的在于，參照 CLSI EP15-A3、CLSI EP6-A、CLSI EP7-A2 等文件，驗證上海北加生化試劑有限公司生產的補體分子 C1q 免疫透射比濁法試劑在 Roche cobas c502 全自動生化分析儀上的性能是否符合要求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Roche cobas c502 全自動生化分析儀為德國 Roche 公司產品。

1.1.2 試劑 C1q 檢測試劑盒（批號：20160815）、C1q 檢測校準品（批號：20161114）、C1q 檢測質控品（低值，批號：20170226、濃度 174 mg/L；高值，批號：20161217、濃度 306 mg/L）均購自上海北加生化試劑有限公司。

1.1.3 標本 在我院體檢中心進行查體的人群中選擇各項生化指標正常，既往無明確腎病、免疫系統疾病、高血壓、糖尿病、腦梗死或冠心病病史，血清生物化學各項指標在參考范圍內且不接近于其上下限，且查體期間無任何自覺癥狀的健康成年人，年齡 25 ~ 40 歲，清晨空腹坐位抽血，要求抽血前無劇烈運動。從符合條件的人群中隨機選取男女各 20 例共 40 例，檢測其血清內 C1q 活性水平。

依據試劑廠家提供的線性范圍（50 ~ 400 mg/L），在日常工作中，篩選新鮮的低值標本和高值標本。

1.2 方法

1.2.1 儀器校準 采用試劑廠家提供的參數，并使用配套校準品進行定標，方法評價期間每日測定 2 個水平定值質控品判斷是否在控，以確保驗證試驗的可行性和準確性。

1.2.2 反應體系配制

1.2.2.1 精密度驗證混合血清 制備一份濃度介于配套質控品兩水平之間的混合血清，分裝 20 份于–20 ℃凍存。從符合條件的人群中隨機選取 10 例男性血清，充分混合，制備混合血清。

1.2.2.2 線性試驗 收集接近廠家提供的線性范圍上限及下限的新鮮臨床標本。

1.2.3 精密度驗證 將試劑配套低值、高值兩水平質控品復溶，分裝成 20 份凍于–20 ℃。參考 CLSI EP15-A3 文件[4]，測定兩水平定值質控品及一份混合血清，連續測定5 d，每天測定 4 次，每兩次間隔時間不少于 2 h。計算各水平批內及批間的標準差 SD 及變異系數 CV。

1.2.4 標本攜帶污染評價 依次測定一份高水平質控品及三份去離子水，連續測定 5 d，每天測定 1 次，計算樣品探針攜帶污染率，接受標準區間為–3% ~ +3%。

1.2.5 正確度驗證 在精密度驗證及標本攜帶污染評價完成且結果良好時，進行后續驗證試驗。因廠家僅提供一個批次的校準品，故參考 CLSI EP15-A3 文件[4]，取低值、高值兩水平廠家定值質控品進行正確度驗證，復溶后上機各測定 5 次，計算偏倚（Bias%）。

1.2.6 線性范圍驗證 參照 CLSI EP6-A 文件[5]，依據試劑廠家提供的線性范圍（50 ~ 400 mg/L）收集新鮮的低值標本（L）與高值標本（H），按體積比例 L、7/8 L + 1/8 H、3/4 L + 1/4 H、5/8 L + 3/8 H、L + H、3/8 L + 5/8 H、1/4 L +3/4 H、1/8 L + 7/8 H及 H 配制成 9 個水平梯度的混合血清，依照低→高、高→低、低→高的順序測定 3 次，計算均值，與預期值 X =（CL× VL+ CH× VH）/（VL+ VH）比較，利用 SPSS19.0 統計軟件檢查所得數據，檢查有無離群值并判斷重復性，然后分別擬合 1 次、2 次、3 次方程進行評價。

1.2.7 最大稀釋度試驗 選取我院住院患者新鮮血清上機檢測，選擇 C1q 水平接近線性范圍上限的標本，參考試劑廠商提供的檢測下限，用生理鹽水 2、4、8、16、32 及64 倍稀釋，分別上機測定 3 次，求平均值，并將檢測結果與稀釋后的預期值比較，得出回收率=（測定值/預期值）× 100%，可接受范圍為 90% ~ 110%。

1.2.8 臨床可報告范圍 在進行過線性范圍驗證、最大稀釋度試驗之后，通過計算確定 C1q 的臨床可報告范圍。

1.2.9 生物參考區間驗證 在以上性能評價試驗完成并通過后，進行參考區間的驗證試驗。參考 CLSI C28-A3 文件[6]，測定結果與已建立的參考范圍（男性 >142 mg/L，女性 > 144 mg/L）比對，檢驗有無離群值。

2 結果

2.1 精密度驗證試驗

配套質控品及混合血清的批內及批間精密度見表 1，其中低值及高值質控批內 CV 分別為 1.34% 及3.03%，批間 CV 分別為 1.57% 及 3.15%。均低于廠家做出的 10%，也低于本實驗室標準（5%）。

表 1 C1q 各水平精密度

2.2 標本攜帶污染評價試驗

C1q 在 cobas c502 上連續 5 d 的攜帶污染率分別為 0.77%、0.72%、0.71%、0.83% 及 0.77%，標本平均攜帶污染率為 0.76%，攜帶污染判斷為合格。

2.3 正確度驗證試驗

配套兩水平質控品（低值 174.0 mg/L、高值 306.0 mg/L）的測定均值分別是 179.0 mg/L 及 311.5 mg/L，偏倚為 2.87% 及 1.80%，均小于本實驗室標準（5%），可確保試驗結果的正確度。

2.4 線性范圍驗證試驗

收集的低值及高值血清接近但略超出廠家提供的線性范圍（50 ~ 400 mg/L），因此分別上機測定 10 次，均值為 46.33 mg/L 及 433.2 mg/L，計算得出重復檢測集合方差（SDr），分別為 2.56% 及 4.76%，均低于本實驗室規定的允許誤差范圍 5%，檢測結果顯示兩血清可以用于線性范圍評價。配制 9 個水平梯度的混合血清，上機檢測并與預期值比較。以預期值為 X 軸、實際測得的均值為 Y 軸進行多項式回歸，數據擬合結果顯示，b2、b3 與 0 比較差異無統計學意義（> 0.05），為一次線性方程，y = 1.0155x（2= 0.9983，< 0.05），線性范圍為 46.33 ~ 433.2 mg/L。線性評價結果見圖 1。

2.5 最大稀釋度試驗

2、4、8、16、32、64 倍稀釋的測定均值、預期值及回收率見表 2，其中 64 及 128 倍稀釋的回收率超過 90% ~ 110% 的可接受范圍，因此在 cobas c502 上 C1q 檢測的最大稀釋倍數為 32 倍。

C1q 實測均值（mg/L）5004003002001000 100 200 300 400 500 C1q 預期值（mg/L）

表 2 最大稀釋度試驗結果

2.6 臨床可報告范圍

依據線性范圍驗證及最大稀釋度試驗結果，以線性范圍上限 433.2 mg/L 稀釋 32 倍計算，C1q 臨床可報告的最高水平為 14259.4 mg/L，臨床可報告范圍為 40.6 ~ 14259.4 mg/L。

2.7 生物參考區間驗證試驗

男女各 20 例血清 C1q 水平測定結果為男性（193.0 ± 50）mg/L、女性（196.3 ± 52）mg/L，均在已建立的參考范圍（男性 > 142 mg/L，女性 > 144 mg/L）內（表 3），可以此作為本實驗室測定 C1q 的參考范圍。

表 3 C1q生物參考區間驗證結果（mg/L）

3 討論

精密度是反映儀器整體檢測性能的重要指標，檢測系統精密度良好是進行后續驗證實驗的前提和保障。由于C1q 檢驗項目，無論是美國《臨床實驗室改進法案修正案》（CLIA’88）或是 ISO 15189 都沒有提供相關的允許總誤差判斷標準，因此本次驗證以本實驗室內規定的 CV < 5% 為判斷標準，驗證實驗所得的 CV 值 2.1% 屬于可接受范圍內，因此判定在 cobas c502 上 C1q 檢測精密度符合標準。

CLSI EP15-A3 文件提供兩種方式來驗證正確度，即方法學比對或分析有證參考物質，后者包括廠家提供的校準物、定值質控物及其他附有證書、可溯源的參考物質。C1q 在國內屬于還未正式開展的檢驗項目，所以無法獲取美國病理學家協會（CAP）或衛生部臨床檢驗中心提供的正確度驗證材料；國內僅有少量醫院將 C1q 檢測應用于臨床，鑒于檢測方法的差異，也無法通過實驗室間比對完成正確度驗證；廠家提供的試劑，其校準品為同一批次，因此本次性能評價采用廠家提供的定值質控進行。結果顯示兩水平質控品的偏倚為 2.87% 及 1.80%，均小于本實驗室標準（5%），可保證檢測的準確性。

線性范圍是指患者標本不經任何預處理、檢驗方法直接測定出待測物的范圍，反映檢測系統的輸出特性。本次實驗中用于驗證的低值、高值血清略超出 50 ~ 400 mg/L 的范圍，但經測定及計算后其 SDr 均未超過本實驗室設定的允許誤差范圍 5%，可以用于線性范圍驗證。所得線性范圍 46.33 ~ 433.2 mg/L，回歸方程為 y = 1.0155x，2= 0.9983，與廠家提供的 50 ~ 400 mg/L、2= 0.9900 略有出入但基本一致，回歸方程顯示呈一次線性，線性評價有意義。

本次驗證實驗得出的最大稀釋度為 32 倍稀釋，回收率在 90% ~ 110% 的可接受范圍內，因此理論上臨床可報告范圍為 40.6 ~ 14259.4 mg/L。在實際報告時一定要結合對應的臨床意義，高值標本測定值超出線性范圍后，一定要將其稀釋至儀器的分析范圍內再做檢測，否則可能造成結果的不準確。

CLSI C28-A3 文件提供 3 種方法來評估參考區間驗證是否可接受：系統性評審；20 個參考值數據驗證；60 個參考值數據驗證。鑒于 C1q 的性別差異，本實驗室嚴格篩選健康成年人男女各 20 例，以驗證試劑廠商提供的參考區間。文件規定，只要 20 個參考數值中不超過 2 個落到已建立的參考區間外，該實驗室就可以采用此參考區間。本次驗證結果男性（193.0 ± 50）mg/L、女性（196.3 ± 52）mg/L，均在廠商提供的參考范圍內。因此，補體 C1q 免疫透射比濁法試劑與配套生化檢測系統相關性良好，符合質量標準，能夠滿足臨床檢測的需要，可以用于臨床檢測。

[1] Fraser DA, Tenner AJ. Directing an appropriate immune response: the role of defense collagens and other soluble pattern recognition molecules. Curr Drug Targets, 2008, 9(2):113-122.

[2] Ho MM, Manughian-Peter A, Spivia WR, et al. Macrophage molecular signaling and inflammatory responses during ingestion of atherogenic lipoproteins are modulated by complement protein C1q. Atherosclerosis, 2016, 253:38-46.

[3] Ding ML, Fan LY. Recent advances in research of cofactor C1q related diseases. Chin J Lab Med, 2015, 38(9):642-645. (in Chinese)

丁夢蕾, 范列英. 補體C1q與疾病發生發展相關性研究的新進展.中華檢驗醫學雜志, 2015, 38(9):642-645.

[4] Clinical and Laboratory Standards Institute. User verification of precision and estimation of bias; approved guideline--third edition. CLSI document EP15-A3. Wayne, Pennsylvania: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2014. [2017-05-10]. https://clsi.org/ standards/products/method-evaluation/documents/ep15/.

[5] Clinical and Laboratory Standards Institute. Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures; a statistical approach; approved guideline. CLSI document EP6-A. Wayne, Pennsylvania: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2003. [2017-05-10]. https://clsi.org/standards/products/method-evaluation/documents/ep06/.

[6] Clinical and Laboratory Standards Institute. Defining, establishing, and verifying reference intervals in the clinical laboratory; approved guideline--third edition. CLSI document C28-A3c. Wayne, Pennsylvania: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2008. [2017-05-10]. https://clsi.org/standards/products/method-evaluation/ documents/ep28/.

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.016

閃全忠，Email：clinchem@163.com

2017-08-25