肺炎鏈球菌蛋白PspC的制備與鑒定

譚亞軍，王麗嬋，衛(wèi)辰，張華捷，侯啟明，張庶民，馬霄

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肺炎鏈球菌蛋白PspC的制備與鑒定

譚亞軍，王麗嬋，衛(wèi)辰，張華捷，侯啟明，張庶民，馬霄

100050 北京，中國(guó)食品藥品檢定研究院百白破疫苗與毒素室/衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

對(duì)肺炎鏈球菌表面蛋白 C（PspC）進(jìn)行全基因合成、重組表達(dá)、純化制備和鑒定。根據(jù) GenBank 中 PspC 的基因序列和氨基酸序列，通過(guò)密碼子優(yōu)化和全基因合成的方式獲得目的蛋白基因，構(gòu)建無(wú)標(biāo)簽、高效重組表達(dá)菌株，建立重組蛋白的純化制備方法，并進(jìn)行抗原鑒定及免疫原性檢測(cè)分析。人工合成的 PspC 基因序列經(jīng)鑒定與預(yù)期一致，目的蛋白在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)，表達(dá)量在 30% 以上，經(jīng)兩步純化后純度達(dá)到 95%。重組蛋白能與肺炎鏈球菌陽(yáng)性血清產(chǎn)生特異性抗原抗體反應(yīng)，免疫小鼠后可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的蛋白特異性抗體。獲得了重組肺炎鏈球菌蛋白 PspC，其具有與天然抗原相似的抗原性和免疫原性，為今后開(kāi)展疫苗研制、載體蛋白應(yīng)用等研究奠定基礎(chǔ)。

肺炎鏈球菌； 重組蛋白質(zhì)類； 肺炎鏈球菌表面蛋白 C

肺炎鏈球菌表面蛋白 C（pneumococcal surface protein C，PspC），也稱為膽堿結(jié)合蛋白 A（choline binding protein A，CbpA），是一個(gè)多型蛋白，分子量在 69 ~ 120 kD 之間，具有與肺炎鏈球菌表面蛋白 A（pneumococcal surface protein A，PspA）高度同源的膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域。主要由信號(hào)肽（37 個(gè)氨基酸），α 螺旋區(qū)，脯氨酸富集區(qū)，膽堿結(jié)合區(qū)和C 端尾巴五個(gè)區(qū)域組成，其 N 端的 α 螺旋區(qū)在不同的肺炎鏈球菌株中大小和序列都高度可變。根據(jù)結(jié)構(gòu)不同，PspC 可分為 Clade A 和 Clade B 兩種類型，其中 Clade A 序列較長(zhǎng)，α 螺旋區(qū)與 PspA 一樣包含 region1 和 region 2 兩個(gè)區(qū)域，Clade B 則只包含 region 1 區(qū)域，分離菌株中 Clade B 所占比例可高達(dá) 96%[1]，兩者與 PspA 都具有交叉反應(yīng)。PspC 既是黏附素，又是侵襲蛋白，還可以與補(bǔ)體 C3、人血清因子 H 結(jié)合，幫助細(xì)菌免于補(bǔ)體旁路途徑的攻擊。由此可見(jiàn)，PspC 是一個(gè)多功能蛋白，在肺炎鏈球菌黏附、入侵和逃避機(jī)體補(bǔ)體系統(tǒng)進(jìn)攻過(guò)程中起主要作用[2]。N 端 α 螺旋區(qū)域雖然可變度大，但形成的空間構(gòu)象種類有限，并具有免疫保護(hù)作用，試驗(yàn)結(jié)果顯示 PspC 的 N 端區(qū)能夠大大提高腹腔或者靜脈攻擊動(dòng)物的存活率[3-11]。因此 PspC 可作為肺炎鏈球菌蛋白疫苗的候選抗原。

本課題根據(jù) GenBank 中 PspC 蛋白的基因序列和氨基酸序列，通過(guò)密碼子優(yōu)化和全基因合成的方式獲得目的基因，構(gòu)建無(wú)標(biāo)簽、高效重組表達(dá)菌株，并對(duì)重組蛋白 PspC 進(jìn)行了純化方法的建立、抗原鑒定及免疫原性檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備 PTC-100 PCR 儀為美國(guó) MJ Research 公司產(chǎn)品；HZQ-QX 恒溫氣浴振蕩器為哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品；Soniprep150 超聲波細(xì)胞破碎儀為日本 Sanyo 公司產(chǎn)品；?KTA Purifier 100 純化儀、ImageMaster VDS 凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó) GE Healthcare 公司產(chǎn)品；Tetra MP4 垂直電泳儀、Trans-Blot SD 半干式電轉(zhuǎn)儀為美國(guó) Bio-Rad 公司產(chǎn)品；Spectramax PLUS 酶標(biāo)儀為美國(guó) Molecular Devices 公司產(chǎn)品。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌 DH5α 和 BL21(DE3) 由中國(guó)食品藥品檢定研究院百白破疫苗與毒素室保存，表達(dá)質(zhì)粒 pET-30a 為德國(guó)默克 Novagen 公司產(chǎn)品。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Balb/c 小鼠由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所提供，小鼠性別為雌性，6 ~ 8周齡，SPF 級(jí)，采用獨(dú)立通氣籠具系統(tǒng)飼養(yǎng)。

1.1.4 主要試劑與耗材 Ex Taq DNA 聚合酶、dNTP、IPTG、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)為日本 Takara 公司產(chǎn)品；T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA 純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒為美國(guó) Promega 公司產(chǎn)品；蛋白純化用層析柱為美國(guó) GE Healthcare 公司產(chǎn)品；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)為美國(guó) Thermo Scientific 公司產(chǎn)品；PVDF 膜為美國(guó) Millipore 公司產(chǎn)品；OPD、DAB 顯色試劑為美國(guó) Sigma 公司產(chǎn)品；HRP 標(biāo)記的羊抗人 IgG 為美國(guó) Santa Cruz 公司產(chǎn)品；瓊脂糖、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris、SDS、甘氨酸、過(guò)硫酸胺、四甲基乙二胺（TEMED）、二硫蘇糖醇（DTT）、硫酸卡那霉素、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽（AEBSF）為美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品；胰蛋白胨、酵母粉為英國(guó) Oxoid 公司產(chǎn)品；甘油、氯化鈉、Na2HPO4、NaH2PO4、氯化鉀等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 PspC 基因序列優(yōu)化和全合成 使用codon usage analyzer 對(duì)PspC 蛋白的 DNA 序列進(jìn)行密碼子使用頻數(shù)分析。依據(jù)大腸桿菌的偏愛(ài)密碼子，同時(shí)考慮 mRNA 翻譯起始區(qū)（translation initiation region，TIR）的二級(jí)結(jié)構(gòu)，調(diào)整 G+C% 含量和分布，利用 Gene Designer 軟件進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以提高蛋白表達(dá)量；并使用 RNAstructure5.2 軟件分析 TIR 二級(jí)結(jié)構(gòu)和自由能，Codonw 在線分析密碼子適應(yīng)指數(shù)（codon adaption index，CAI）；同時(shí)在 5'端引入I 酶切位點(diǎn)（CATATG），3'端I 酶切位點(diǎn)前加入雙終止密碼子（TAATAA），以保證基因序列的無(wú)標(biāo)簽表達(dá)。根據(jù)優(yōu)化的核苷酸序列，采用重疊延伸 PCR 技術(shù)進(jìn)行全基因合成。PspC 的表達(dá)基因序列長(zhǎng)度為 1365 bp。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 合成的PspC 基因序列與表達(dá)質(zhì)粒 pET30a 經(jīng)I、I 酶切、連接、構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株 BL21(DE3) 中。挑取轉(zhuǎn)化后的單一菌落接種到含50 μg/ml 卡那霉素的 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜后提取質(zhì)粒，分別進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增、雙酶切鑒定及測(cè)序以篩選出陽(yáng)性克隆。

1.2.3 重組蛋白PspC 的誘導(dǎo)表達(dá) 取陽(yáng)性克隆37 ℃振蕩培養(yǎng)復(fù)蘇；按 1:50 轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)至550 nm值達(dá) 0.6 ~ 0.8；加入 IPTG 至終濃度 1 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá) 4 h，以含空載體 pET-30a 的菌株作為陰性對(duì)照；離心收集菌體后用 pH 8.9 的 20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液重懸，冰浴中超聲破碎菌體，分別對(duì)未超聲菌體、超聲沉淀和上清取樣進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳分析，以分析目的蛋白的表達(dá)水平和鑒定蛋白的表達(dá)形式。

1.2.4 重組蛋白 PspC 的純化 對(duì)重組蛋白進(jìn)行放大誘導(dǎo)表達(dá)和純化制備。收集的菌體用緩沖液 A1（50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.5）懸浮，冰浴超聲破碎；4 ℃，12 000 r/min離心 30 min，取上清加入硫酸銨至 1 mol/L，進(jìn)行 Butyl HP 疏水層析，以含 1 ~ 0 mol/L 硫酸銨的緩沖液 A1 梯度洗脫；收集目的洗脫液進(jìn)行 DEAE FF 離子交換層析，以含 0 ~ 1 mol/L NaCl 的緩沖液 A2（20 mmol/L Tris，pH 9.5）梯度洗脫。分別取少量收集液進(jìn)行 SDS-PAGE 檢測(cè)和純度分析。

1.2.5 重組蛋白 PspC 的鑒定及免疫原性檢測(cè)

1.2.5.1 ELISA 檢測(cè) 以 3 μg/ml 的純化蛋白每孔 100 μl 包被酶標(biāo)板，設(shè)復(fù)孔，4 ℃放置過(guò)夜；檢測(cè)前洗板6 次，然后以每孔200 μl 加入封閉液，37 ℃封閉 1 h；洗板 3 次后，取稀釋好的肺炎鏈球菌感染患者血清（1:40 稀釋）按每孔 100 μl 加入酶標(biāo)板中，37 ℃孵育 1 h；洗板 6 次，每孔加入100 μl 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人 IgG（1:3000 稀釋），37 ℃孵育 1 h；洗板 6 次，每孔加 OPD 底物100 μl，37 ℃靜置 20 min，然后以每孔加入50 μl 2 mol/L H2SO4溶液終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀在波長(zhǎng) 490 nm 讀取檢測(cè)數(shù)據(jù)。同時(shí)設(shè)置 PBS（mmol/L、mmol/L、mmol/LNaHPO、2 mmol/LKHPO作為陰性對(duì)照。

1.2.5.2 Western blot 鑒定 重組蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，按照常規(guī)方法進(jìn)行 Western blot 鑒定，檢測(cè)用陽(yáng)性血清及二抗同1.2.5.1 項(xiàng)，加底物反應(yīng)液 DAB 顯色，顯色終止后拍攝照片。

1.2.5.3 免疫原性檢測(cè) 采用雌性 Balb/c 小鼠（6 ~ 8 周齡），腹部皮下接種稀釋的重組蛋白 5 μg，免疫小鼠 6 只，分別于第 0，14，28 天免疫 3 次，第 35 天采血，分離血清，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組。采用間接 ELISA 法檢測(cè) 3 針免疫后血清中PspC 蛋白的特異性抗體滴度。將純化后蛋白 3 μg/ml 包被酶標(biāo)板，待檢血清稀釋至合適倍數(shù)（起始稀釋倍數(shù)為 1:100），以每孔 200 μl 加入酶標(biāo)板 A 排，以 100 μl 體系對(duì)樣品進(jìn)行系列倍比稀釋，檢測(cè)用二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG（1:3000 稀釋），同時(shí)以對(duì)照血清作為陰性對(duì)照。陽(yáng)性判定的 Cut-off 值為 2.1 × 陰性對(duì)照值。

1.2.5.4 與 PspA 蛋白的交叉反應(yīng)分析 將重組蛋白 PspC 和課題組之前已完成的來(lái)自肺炎鏈球菌株 DBL6A、RX1 和 EF3296 的三種蛋白PspA1、PspA2、PspA3 以 3 μg/ml 分別包被酶標(biāo)板，檢測(cè)抗體為1.2.5.3 中的 PspC 免疫小鼠血清，其余操作步驟同1.2.5.1 項(xiàng)。

2 結(jié)果

2.1 PspC 基因序列優(yōu)化和全合成

本研究選擇具有代表性 N 端區(qū)域的 PspC 蛋白，根據(jù)氨基酸序列信息進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)所需的模板 DNA，通過(guò)避開(kāi)常用酶切位點(diǎn)，調(diào)整 GC 含量，使優(yōu)化后的基因序列密碼子出現(xiàn)頻率都在 20% 以上，CAI 為 0.74，TIR 自由能為–5.4 kcal/mol。新設(shè)計(jì)基因 mRNA 的 TIR 穩(wěn)定性有所降低，結(jié)構(gòu)較松散，有利于翻譯效率的提高。采用重疊延伸 PCR 技術(shù)獲得PspC 的全基因合成產(chǎn)物。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

PspC 基因片段長(zhǎng)度是 1365 bp，其 DNA 產(chǎn)物和 pET-30a 連接構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。以表達(dá)質(zhì)粒為模板，采用通用引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度與預(yù)期大小一致；對(duì)表達(dá)質(zhì)粒用I 和I 雙酶切鑒定，結(jié)果顯示插入片段大小與預(yù)期一致，結(jié)果見(jiàn)圖 1。篩選出的陽(yáng)性克隆經(jīng)序列測(cè)定后進(jìn)一步確證了連接的正確性。

bp M 1 bp M 1 750050002500 1000 250A 750050002500 1000 250B

Figure 1 Identification by PCR (A) and enzyme digestion (B) for expression plasmid of PspC protein

2.3 重組蛋白 PspC 的表達(dá)結(jié)果

經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)條件的摸索，PspC 蛋白在大腸桿菌 BL21(DE3) 中得到了高效表達(dá)。電泳掃描分析顯示 PspC 表達(dá)條帶的分子量與實(shí)際大小（52 kD）有些偏移，與文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道一致。目的蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白的 30% 以上。超聲破菌后收集的上清和沉淀經(jīng) SDS-PAGE 分析可見(jiàn) PspC 重組蛋白，主要存在于超聲裂解上清，以可溶形式表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖 2A。

kD M 1 2 3 4 5 6 9766 43 31 20 14AB

Figure 2 Results of recombination expression and purification analysis (A) and immunoblot identification (B) of PspC protein

2.4 重組蛋白 PspC 的純化結(jié)果

PspC 蛋白以無(wú)標(biāo)簽形式表達(dá)，純化難度較大，經(jīng)過(guò)對(duì)不同純化方法及不同純化條件的一系列摸索，確定了合適的純化方案。PspC 蛋白經(jīng)疏水層析、離子交換層析純化，獲得的目的蛋白純度可達(dá) 95%，結(jié)果見(jiàn)圖 2A。

2.5 重組蛋白 PspC 的鑒定及免疫原性檢測(cè)

2.5.1 重組蛋白 PspC 的 ELISA 和 Western blot 鑒定結(jié)果 采用肺炎鏈球菌感染患者血清對(duì)重組蛋白 PspC 進(jìn)行 ELISA 檢測(cè)，樣品490 nm為 2.003、2.07，陰性對(duì)照490 nm為 0.238，結(jié)果為陽(yáng)性；同時(shí)進(jìn)行 Western blot 鑒定，結(jié)果顯示顯色條帶位置與預(yù)期一致（圖 2B）。上述表明PspC 表達(dá)產(chǎn)物能與陽(yáng)性血清發(fā)生特異性的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，重組蛋白具有良好的抗原特異性。

2.5.2 重組蛋白 PspC 的免疫原性檢測(cè) PspC 重組蛋白免疫小鼠 3 針后，采用間接 ELISA 法檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)的蛋白特異性 IgG 抗體滴度，結(jié)果顯示PspC 蛋白可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的蛋白特異性抗體，滴度在1:1600，1:3200，1:6400，1:12 800的頻數(shù)分別為1，1，3，1，計(jì)算幾何平均滴度為 5080，表明重組蛋白具有良好的免疫原性。

2.5.3 與 PspA 蛋白的交叉反應(yīng)分析 重組蛋白 PspC 和 PspA1、PspA2 、PspA3 蛋白作為包被抗原分別檢測(cè) PspC 免疫小鼠血清，結(jié)果顯示 PspC 與來(lái)源于不同分支肺炎鏈球菌的 PspA 蛋白存在不同的交叉反應(yīng)性，見(jiàn)表 1。

表 1 重組蛋白 PspC 與 PspA 蛋白的交叉反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果

3 討論

本研究所表達(dá)的目的蛋白 PspC 是一多型蛋白，選擇具有代表性 N 端區(qū)域的PspC 蛋白，根據(jù)氨基酸序列信息進(jìn)行基因序列優(yōu)化和全合成，獲得了高效表達(dá)。這種方法不僅可以免去對(duì)肺炎鏈球菌的培養(yǎng)過(guò)程，而且目的基因的獲得不受現(xiàn)有菌株的限制，并可以通過(guò)基因密碼子的優(yōu)化，提高目的蛋白的表達(dá)水平。

為了避免融合標(biāo)簽對(duì)目標(biāo)蛋白的潛在不利影響，防止應(yīng)用時(shí)對(duì)人體存在的潛在威脅，本研究在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)將終止密碼子添加在融合標(biāo)簽之前，使表達(dá)出的蛋白不帶任何標(biāo)簽。經(jīng)疏水層析、離子交換層析等多種純化方法聯(lián)合應(yīng)用和條件優(yōu)化，建立了 PspC 蛋白的純化方法，獲得的無(wú)標(biāo)簽重組蛋白純度可達(dá) 95%。ELISA 和 Western blot 鑒定結(jié)果顯示，重組PspC 蛋白能夠與肺炎鏈球菌感染患者血清發(fā)生特異性結(jié)合，說(shuō)明該蛋白具有良好的抗原特異性。免疫小鼠三針后，可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的蛋白特異性抗體，說(shuō)明其也具有良好的免疫原性，為將來(lái)肺炎鏈球菌重組蛋白在疫苗研制、載體蛋白應(yīng)用等研究方面奠定了基礎(chǔ)。

不同類型的 PspC 與 PspA 因膽堿結(jié)合結(jié)構(gòu)域的同源性而具有一定的交叉反應(yīng)性，本研究通過(guò)交叉反應(yīng)分析得出制備的 PspC 蛋白與不同分支來(lái)源的肺炎鏈球菌的 PspA 蛋白存在不同的交叉反應(yīng)性，其中與源自 DBL6A、RX1 菌株的 PspA 有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)，而與源自 EF3296 菌株的 PspA 沒(méi)有交叉反應(yīng)。說(shuō)明單獨(dú)應(yīng)用一種 PspC 或 PspA 蛋白可能不能針對(duì)不同類型菌株產(chǎn)生足夠的抗體保護(hù)性，將其作為疫苗的候選蛋白，可能需要幾種不同類型的蛋白組合才能預(yù)防更廣范圍的肺炎鏈球菌感染[14-15]。

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Preparation and identification of recombinant Streptococcus pneumoniae protein PspC

TAN Ya-jun, WANG Li-chan, WEI Chen, ZHANG Hua-jie, HOU Qi-ming, ZHANG Shu-min, MA Xiao

National Institutes for Food and Drug Control, Key Laboratory of the Ministry of Health for Research on Quality and Standardization of Biotech Products, Beijing 100050, China

To perform the gene synthesis, recombinant expression, preparation and identification of the Streptococcus pneumoniae protein PspC.The gene of PspC was obtained by chemical synthesis after codons optimization according to the gene sequence and amino acid sequence in the GenBank. The label-free and efficient recombinant expression strain was constructed by molecular biological methods. The purification method of recombinant protein was established. And the protein’s antigen identification and immunogenicity was tested.The synthetic gene sequence of PspC was consistent with the database. The recombinant protein was highly expressed inExpression of the target protein accounted for more than 30% of the total bacterial proteins. After purification by two-step chromatography, the protein purity reached 95%. The protein could react with human serum of clinically diagnosed pneumonia, indicating the protein had good antigenicity. Also high level of specific antibody could be induced after immunization with the protein in mice.The recombinant Streptococcus pneumoniae protein PspC is successfully prepared without label, which had similar antigenicity and immunogenicity as that of natural protein. This research provides foundation for future research on vaccine development and carrier protein application.

Streptococcus pneumoniae; Recombinant proteins; Pneumococcal surface protein C

MA Xiao, Email: maxiao421@sina.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.003

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863 計(jì)劃）（2012AA02A402）

馬霄，Email：maxiao421@sina.cn

2017-06-09