HPLC法定量測定酵母發酵上清液中重組新蛭素的含量

劉玉斌，于愛平，劉農樂，吳祖澤，靳繼德

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HPLC法定量測定酵母發酵上清液中重組新蛭素的含量

劉玉斌，于愛平，劉農樂，吳祖澤，靳繼德

100022 北京工業大學生命科學與生物工程學院（劉玉斌）；100850 北京，軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所（劉玉斌、于愛平、劉農樂、吳祖澤、靳繼德）

建立 HPLC 技術定量測定發酵上清液中重組新蛭素（EH）含量的方法，用于監測發酵過程中EH 的表達量變化與誘導時間的關系，使 EH 產量最大化。利用 HPLC 技術建立 EH 的檢測方法，通過對該方法的靈敏度、精密度和加標回收率實驗的考察，確立該方法的可行性；利用該方法對 EH 樣品進行穩定性考察，并對酵母發酵上清液進行跟蹤檢測。實現了對發酵過程中發酵上清液中 EH 的實時監測。EH 在 214 nm 處有較強的特異性吸收峰，其吸收峰面積與含量存在很好的線性關系，2= 0.9995，EH 線性濃度范圍在 0.012 ~ 4.8 mg/ml。該測定方法具有很好的精密度，樣品多次重復測定的 RSD 值為 1.4227%；加標回收率在 95% ~ 98%。應用該方法對 EH 樣品的穩定性測定結果顯示，樣品 4 ℃保存穩定性較好，24 h 內樣品主峰面積百分比 > 95%，在 20 ℃條件下，8 h 內樣品穩定性良好，主峰面積百分比 > 95%。該方法準確度高、重復性好，進行測定時，可根據 EH 的特異吸收峰，對發酵過程中發酵上清液中 EH 含量進行實時定量測定。測定結果顯示，在一定時間范圍內，EH 的表達量與誘導時間成正相關。本研究建立了 HPLC 技術檢測 EH 含量的方法，該方法可用于發酵過程中 EH 的實時定量監測，使 EH 的產量達到最大值，為 EH 的臨床樣品制備提供有力支持。

酵母表達系統； 重組新蛭素； 高效液相色譜； 實時監測

血栓性疾病發病率逐年增高，嚴重威脅著人類的健康和生命。抗凝類藥物是預防和治療血栓性疾病的重要手段，但抗凝藥普遍存在的出血副作用給臨床用藥造成極大的不便。重組新蛭素（EH）是運用生物工程技術在水蛭素的氨基末端連接可被凝血因子Xa/XIa 識別切割的多肽而成，該多肽封閉了水蛭素的抗凝活性，但經過凝血因子 Xa/XIa 酶解后，EH 可產生抗血栓的作用。EH 這種結構特點和作用機制減少了系統出血的風險，提高了抗栓的特異性和作用效率[1-2]。作為一種新型抗凝藥物，新蛭素的研發將對血栓性疾病的預防和治療起到重要作用。EH 采用畢赤酵母表達系統進行生產[3]。在發酵生產過程中，為了監測目的蛋白表達與甲醇誘導之間的關系，需要經常對目的蛋白的表達量進行檢測，以選擇最佳誘導條件。SDS-PAGE 電泳、毛細管電泳[4-5]是進行目的蛋白分析的常規方法，然而它們不但定量不精確，而且耗時較久。特別是 EH 蛋白在發酵過程中穩定性較差，容易發生降解。在發酵后期，EH 蛋白可在 4 ~ 8 h 內迅速降解，用常規的檢測方法不能及時有效地反饋發酵液中 EH 蛋白含量的變化。如何用一個新方法既精確又快速地檢測發酵過程中 EH 的表達情況是本研究的重點。反相高效液相色譜在生物技術分離純化分析中具有重要作用，廣泛用于多肽、蛋白質分離純化工藝中，具有較高的分辨率[6-7]，可以快速、準確地分析發酵上清中各種蛋白的組成及含量。目前，高效液相色譜分析蛋白在國內外已經進行了一定的研究，貢雯玉等[8]用高效液相色譜法檢測出鯽魚不同組織中的膠原蛋白含量；劉利娟等[9]用反相高效液相色譜法測定鮮牛乳中的乳清蛋白，得到的蛋白濃度與 HPLC 峰面積均有很強的線性關系。本實驗室已經建立了反相高效液相色譜技術分析 EH 純度的方法，在此基礎上，本研究擬采用 HPLC 技術建立快速定量檢測 EH 含量的方法，以用于發酵過程中目的蛋白的動態監測。

1 材料與方法

1.1 材料

HPLC 系統為美國 Agilent 公司產品，DAD 檢測器、色譜柱為 TechMate C18-ST，5 μmol/L，4.6 mm × 250 mm，為北京泰克美高新技術有限公司產品；乙腈（色譜級）購于Fisher Chemical 公司；三氟乙酸（色譜級）購自 Acros Organics 公司；發酵罐購自德國 B.Braun Biotech International 公司；重組新蛭素 EH 原液標準品（批號：20161109）為本實驗室制備，純度 > 97%。

1.2 方法

1.2.1 HPLC 檢測方法 流動相 A 為含 0.1% 三氟乙酸的水溶液，流動相 B 為含 0.1% 三氟乙酸的乙腈溶液，60 min 內 5% ~ 100% 流動相B 進行梯度洗脫，60 ~ 65 min 內 100% ~ 5% 流動相B 梯度洗脫，65 ~ 80 min5% 流動相B 進行平衡，流速 1.0 ml/min，檢測波長 214 nm，柱溫 30 ℃。

1.2.2 線性關系及靈敏度考察 取 EH 原液標準品（24 mg/ml），分別稀釋5、10、20、30、50、100、250、500、1000、2000、4000 倍；濃度分別為 4.8、2.4、1.2、0.8、0.48、0.24、0.096、0.048、0.024、0.012、0.006 mg/ml，用反向高效液相色譜儀進行檢測，方法同 1.2.1，進樣量為 4 μl。

1.2.3 精密度考察 取 EH 原液標準品（24 mg/ml）稀釋至 0.24 mg/ml，用反向高效液相色譜儀進行檢測，重復進樣 8 次，方法同 1.2.1，進樣量 4 μl，得 EH 的峰面積，計算其 RSD 值。

1.2.4 加標回收率 在一定量 EH 發酵離心上清（250 μl）中添加等體積的不同濃度（3 組，依次為 0.48、0.24、0.096 mg/ml）的 EH，混勻，用反向高效液相色譜儀進行檢測，方法同 1.2.1，進樣量為 4 μl，計算 EH 的加標回收率。

加標回收率（%）=（實測值 – 發酵離心上清中 EH 含量）/添加值 × 100%

1.2.5 樣品穩定性考察 取同一 EH 樣品溶液（2.4 mg/ml）在 4 ℃和 20 ℃分別放置 0、4、8、12、16、20、24 h，用反向高效液相色譜儀進行檢測，方法同 1.2.1，進樣量 10 μl，測定其峰面積，分析主峰百分比。

1.2.6 發酵上清檢測 在重組新蛭素發酵過程中，誘導并開始收集樣品，每 4 h取一次樣，發酵液經 8000 r/min 離心 5 min 后取上清，上清經 0.22 μm 的濾器過濾后，用反向高效液相色譜儀進行檢測，方法同 1.2.1，上樣量為 4 μl。

2 結果

2.1 色譜檢測波長的選擇

取同一樣品分別在 214、225、238、280 nm 處檢測（圖 1），在 214 nm 處的光譜區域蛋白吸收靈敏度高，并且基線平穩，在 280 nm 處吸收值較低，其他吸收波長處基線噪聲大，基線波動大，并且發酵液上清中 EH 的含量比較低，故選用214 nm 為檢測波長。

A

B

C D

圖 1 不同紫外檢測波長（A：214 nm；B：225 nm；C：238 nm；D：280 nm）分析 EH 的 HPLC 圖譜

Figure 1 HPLC chromatograms of EH at different wavelengths (A: 214 nm; B: 225 nm; C: 238 nm; D: 280 nm)

2.2 線性關系及靈敏度考察

蛋白濃度 2.4 mg/ml，進樣量為 4 μl 的HPLC 圖譜如圖 2。對 12 組峰面積進行積分，以 EH 蛋白濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制工作曲線，得到回歸方程 Y = 5 × 106X + 62767（2= 0.9995），結果 EH 溶液在濃度 0.012 ~4.8 mg/ml 范圍內呈現良好的線性關系（圖 3），蛋白濃度在0.012 mg/ml 以下和 4.8 mg/ml 以上不在線性范圍內；靈敏度考察，本實驗中 EH 的最低檢測限為 0.012 mg/ml、最高檢測限為 4.8 mg/ml。

mAU 時間（min）Time (min)

Figure 2 HPLC chromatogram of EH standard solution at 2.4 mg/ml

2.3 精密度考察

得到 EH 的 8 次重復 HPLC 圖譜，依次積分，得到的峰面積值為 1164916、1143475、1131982、1123361、1135024、1115562、1162181、1144081，峰面積平均值為 1140073。其峰面積 RSD = 1.4227%（n = 8），變異系數小于 10%，精密度良好，符合測定要求。

峰面積Peak area25 × 106 20 × 106 15 × 106 10 × 106 5 × 106 0 1 2 3 4 5 濃度（mg/ml）Concentration (mg/ml)

Figure 3 Standard curve of EH by HPLC

2.4 加標回收率

在 EH 發酵離心上清中添加等體積的不同濃度的 EH 的加標回收率試驗結果（表 1）顯示，測得發酵液上清峰面積為 1274440，對應的蛋白濃度0.2423 mg/ml，加入的三個不同濃度梯度 EH 的樣品的實測峰面積分別為 1832514、1243183、902712，其對應的蛋白濃度分別為 0.3540、0.2361、0.1680 mg/ml。根據公式算得回收率分別為 97.02%、95.79%、97.60%，結果表明在該出峰時間沒有其他雜蛋白的干擾，因此該方法用于 EH 發酵上清中目的蛋白的跟蹤檢測可靠性較高。

2.5 樣品穩定性考察

HPLC 測定結果顯示，在 4 ℃環境下，樣品濃度為 2.4 mg/ml 時，24 h 內樣品穩定性良好，主峰面積百分比 > 95%（表 2），在 20 ℃環境下，8 h 內樣品穩定性良好，主峰面積百分比 > 95%（表 3）。

表 1 加標回收率

表 2 4 ℃穩定性考察

表 3 20 ℃穩定性考察

2.6 發酵上清檢測

從甲醇誘導開始，每 4 h 取一個樣，進行 HPLC 檢測。發酵液上清的 HPLC 圖譜（圖 4）。以誘導時間為橫坐標（X），HPLC 目的蛋白峰面積為縱坐標（Y）繪制工作曲線（圖 5）。HPLC 的數據顯示，在一定時間范圍內，EH 的表達量與誘導時間成正相關，在誘導 100 h 時，目標蛋白峰峰面積達到最大值，EH 最大表達量 0.51 mg/ml，之后 EH 出現降解，108 h 時發生明顯降解。

3 討論

反相液相色譜柱填料主要以硅膠為基質，在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團（ODS）稱為 C18 柱，C18 柱穩定性較高，長的烷基鏈保護了硅膠基質，基團空間體積較大，有效孔徑小，C18 色譜柱更適合分離小分子化合物[10-11]。其他常用的反相柱還有 C8、C4、C2 和苯基柱等。C4、C2 常用來分離分子量較大的蛋白，C8 用來分離中等大小的蛋白，EH的分子量約為 7 kD，因此本實驗選用 C18 來分析 EH 蛋白。常用的蛋白紫外檢測波長有214、225、238、280 nm[12]，因為蛋白質分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在 280 nm 處具有最大吸收，并且各種蛋白質的這三種氨基酸的含量差別不大，因此紫外吸收法測定蛋白質含量常選用280 nm 處的吸光度值。但由于蛋白質溶液在 280 nm 處的吸收峰較弱，當蛋白含量很低的時候則不能使用 280 nm 的吸光度測定。蛋白質溶液在 238 nm 處的光吸收值的強弱，與肽鍵的多少成正比，但多種有機物，如醇、酮、醛、醚、酰胺類和過氧化物等都對測定結果有干擾作用。本研究采用 214 nm 吸光度值進行測定，結果證明，在 214 nm 處的光譜區域EH 蛋白吸收靈敏度高，并且基線平穩，可以很好地反映溶液中的蛋白含量。

與傳統的電泳技術檢測發酵上清重組新蛭素含量的方法相比，HPLC 技術具有操作簡便、分析速度快、準確度和精確度高、重復性好等優點[13]，可以快速準確地分析出發酵過程中 EH 的表達量，具有較強的實用性。該法彌補了目前該類蛋白檢測方法的不足，做到發酵過程中 EH 表達量的實時監測，也為其他類似的蛋白含量的測定提供了參考。

mAU 時間（min）Time (min)

Figure 4 HPLC chromatogram of fermentation supernatant

峰面積Peak area30 × 105 25 × 105 20 × 105 15 × 105 10 × 105 5 × 105 0 20 40 60 80 100 120 誘導時間（h）Induction Time (h)

Figure 5 The relationship between peak area of EH in fermentation supernatant and different induction time

[1] Zhang C, Yu A, Yuan B, et al. Construction and functional evaluation of hirudin derivatives with low bleeding risk. Thromb Haemost, 2008, 99(2):324-330.

[2] Wang WW, Xu XW, Zhao ZY, et al. Anti-thrombus activity of a novel anti-thrombus protein EPR-hirudin. Chin Pharm J, 2013, 48(2):111- 115. (in Chinese)

王文文, 徐向偉, 趙專友, 等. 谷氨酸-脯氨酸-精氨酸-水蛭素抑制血栓形成的實驗研究. 中國藥學雜志, 2013, 48(2):111-115.

[3] Hao MQ, Li YY, Liu CJ, et al. Pilot-scale fermentation study of a low bleeding anticoagulant protein in pichia pastoris. Lett Biotechnol, 2013, 24(3):314-319. (in Chinese)

郝木強, 李彥英, 劉春杰, 等. 重組低出血抗凝蛋白在畢赤酵母中的中試發酵工藝研究及其純化與鑒定. 生物技術通訊, 2013, 24(3): 314-319.

[4] Alban A, David SO, Bjorkesten L, et al. A novel experimental design for comparative two-dimensional gel analysis: two-dimensional difference gel electrophoresis incorporating a pooled internal standard. Proteomics, 2003, 3(1):36-44.

[5] Dawod M, Arvin NE, Kennedy RT. Recent advances in protein analysis by capillary and microchip electrophoresis. Analyst, 2017, 142(11):1847-1866.

[6] Wagner BM, Schuster SA, Boyes BE, et al. Superficially porous particles with 1000? pores for large biomolecule high performance liquid chromatography and polymer size exclusion chromatography. J Chromatogr A, 2017, 1489:75-85.

[7] Sanz-Nebot V, Benavente F, Toro I, et al. Optimization of HPLC conditions for the separation of complex crude mixtures produced in the synthesis of therapeutic peptide hormones. Chromatographia,2001, 53(Suppl 1):S167-S173.

[8] Gong WY, Bian H, Wu HH, et al. Determination of collagen in different tissues of crucian carp (carassius auratus) by high performance liquid chromatography. Food Sci, 2015, 36(14):65-69. (in Chinese)

貢雯玉, 卞歡, 吳海虹, 等. 高效液相色譜法檢測鯽魚不同組織中的膠原蛋白含量. 食品科學, 2015, 36(14):65-69.

[9] Liu LJ, Liu YP, Mu GQ, et al. Determination of whey protein in fresh milk by reversed phase high performance liquid chromatography. Food Sci Technol, 2015, 40(5):313-317. (in Chinese)

劉利娟, 劉彥品, 牟光慶, 等. 反相高效液相色譜法同時測定鮮牛乳中的乳清蛋白. 食品科技, 2015, 40(5):313-317.

[10] Song XY, Yang H. Selection and application of chromatographic column. Anal Instrumentation, 2016, (6):84-88. (in Chinese)

宋學英, 楊華. 色譜柱的選擇及應用. 分析儀器, 2016, (6):84-88.

[11] Hong XX, Shi Y, Song XJ, et al. Advancement and application of liquid chromatographic column packings in the standardization of drugs. Chin J Pharm Anal, 2017, 37(2):191-201. (in Chinese)

洪小栩, 石瑩, 宋雪潔, 等. 液相色譜柱進展及其在藥品標準中的應用. 藥物分析雜志, 2017, 37(2):191-201.

[12] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China. Volume 3, 2015. Beijing: China Medical Science Press, 2015:401. (in Chinese)

國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典. 2015年版三部. 北京: 中國醫藥科技出版社, 2015:401.

[13] Andrews AT. Protein purification principles, high resolution methods and applications : By J. C. Janson & L. Ryden. VCH, New York, 1989. ISBN 0-89573-122-3. xi + 502 pp. Price: ￡44·45. Food Chem, 1991, 41(3):361-363.

Determination of recombinant neorudin in yeast fermentation supernatant by HPLC

LIU Yu-bin, YU Ai-ping, LIU Nong-le, WU Zu-ze, JIN Ji-de

College of Life Science and Bioengineering, Beijing University of Technology, Beijing 100022, China(LIU Yu-bin); Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China (LIU Yu-bin,YU Ai-ping, LIU Nong-le, WU Zu-ze, JIN Ji-de)

To develop a practical method for the determination of recombinant neorudin (referred to as the EH) in yeast fermentation supernatants by HPLC, in order to monitor of the relationship between the expression of recombinant EH and induction time during the fermentation process to optimize the induction time for maximizing the yield of EH.The relationship between the EH and ultraviolet absorption was detected by HPLC to establish a method to determine the quantity of EH protein. The feasibility of the method was further validated with regard to the sensitivity, precision and recovery rate. The stability of EH and the trace EH in yeast fermentation supernatants were examined using the method.A strong absorption peak at 214 nm was found for EH, having high sensitivity with RSD value of 1.4227%. Good linearity in the EH concentration range of 0.012 - 4.8 mg/ml with2= 0.9995 was observed. Standard addition recovery rate was between 95% and 98%. The result of the EH stability showed that the sample had a good preservation stability, with main peak area percentage being over 95% at 4 ℃ for 24 h or at 20 ℃ for 8 h. The expression of EH in yeast fermentation supernatantswas related to the induction time of methanol.The method for detecting the contents of EH by HPLC is established. Real-time monitoring of EH in yeast fermentation supernatants to get the maximum production of EH will be achieved.

Yeast expression system; Recombinant neorudin; HPLC; Real-time monitoring

JIN Ji-de, Email: jinjide505@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.002

國家“重大新藥創制”科技重大專項（2012ZX09102301-008）

靳繼德，Email：jinjide505@163.com

2017-07-21