昆蟲性信息素結合蛋白功能研究進展

田志強，孫麗娜，李艷艷，張懷江，閆文濤，岳 強，全林發，仇貴生

（中國農業科學院果樹研究所，遼寧興城125100）

昆蟲性信息素結合蛋白功能研究進展

田志強，孫麗娜，李艷艷，張懷江，閆文濤，岳 強，全林發，仇貴生

（中國農業科學院果樹研究所，遼寧興城125100）

嗅覺系統在昆蟲的生命活動中具有重要的功能作用。通過嗅覺蛋白來識別環境中以及種內所釋放的化學信號物質，進而指導昆蟲完成求偶，躲避天敵等生命活動。近些年來，隨著轉錄組測序技術的日益發展，許多昆蟲的嗅覺家族相關基因已被鑒定。而性信息素結合蛋白(pheromone binding protein,PBPs)因其功能的特殊性與重要性，一直以來備受研究者的關注。目前，豐富的科學手段，例如電壓鉗，RNAi，EAG等已為嗅覺蛋白功能做出了不同的闡述，并有一些新的發現，但目前尚存在一些問題亟待解決。筆者根據國內外近些年的研究進展，從昆蟲性信息素結合蛋白的理化性質、不同組織表達模式及其與其他嗅覺相關蛋白之間的關系等方面進行了綜述。

性信息素結合蛋白；觸角；昆蟲；嗅覺基因；功能

0 引言

昆蟲的嗅覺系統在其適應環境的過程中發揮了不可替代的作用，對其尋找配偶及產卵場所，躲避天敵等行為產生了重要影響[1-2]，其中求偶交配行為對于昆蟲種群的繁衍發展等具有重要的意義。昆蟲腦部觸角葉一般由兩個平行亞系統組成，一個主要負責處理寄主植物氣味，而另一個特化為專門處理種內或相似種之間的性信息素[3]。目前，研究者已就普通氣味結合蛋白(General Odorant Binding Proteins，GOBPs)和性信息素結合蛋白(Pheromone Binding Protein，PBPs)分別作為氣味結合蛋白(Odorant Binding Proteins，OBPs)開展了廣泛研究。關于求偶交配行為發生的第一步，目前被普遍認為是性信息素結合蛋白識別并結合性信息素分子后，將其運輸至嗅覺受體發生級聯放大反應，進而指導昆蟲進行求偶行為。

昆蟲對性信息素分子的識別主要由分布在觸角上的感受器完成，氣味分子能夠穿過感受器表面布著的微孔(Pore)進入觸角感受器，與淋巴液中相對應的氣味結合蛋白結合，而后被運送至感覺神經元膜上的氣味受體(Olfactory Receptor，ORs)[4]。性信息素結合蛋白首先在多音天蠶(Antheraea polyphemus)中被分離、鑒定，因其能夠與信息素特異性結合而命名為性信息素結合蛋白[5]。隨后Sandler等首先通過X-射線對家蠶PBP晶體結構進行了分析，發現由6個反向平行的α螺旋構成的燒瓶狀結合兜可以與性信息素成分特異性結合[6]。目前，隨著不同昆蟲性信息素成分以及植物揮發物成分被鑒定，越來越多的研究者將其作為研究對象，旨在為害蟲監測及防治提供策略，從而達到綠色防治的目標。為闡明性信息素分子等氣味分子與性信息素結合蛋白的運輸及作用機制，引發了學者們對性信息素結合蛋白結構與功能的研究興趣。

1 性信息素結合蛋白的分子特征

昆蟲的PBPs是一類由120～160個氨基酸組成的酸性、水溶性的小蛋白分子。隨著家蠶、果蠅等模式昆蟲的嗅覺相關蛋白研究日益深入，棉鈴蟲、舞毒蛾、梨小食心蟲等昆蟲的嗅覺相關基因也逐步被鑒定。根據已有研究的分析發現它們存在以下2個共同點：（1）其N端的信號肽序列約有20個氨基酸，而其功能蛋白則將信號肽切除；（2）盡管PBPs蛋白序列比對結果顯示其一致性在30%～75%，但一般都具有6個保守的半胱氨酸，并通過特定的組合方式形成3個二硫鍵。此結構一方面可以穩定蛋白結構，另一方面二硫鍵所形成的α螺旋疏水結合腔可以調控性信息素分子的結合與釋放。

PBPs在水溶性的血淋巴（感器液）中選擇性地結合性信息素分子而過濾掉其他無關的氣味分子，與性信息素分子形成復合物后與樹突膜上的G-蛋白偶聯受體相作用并引發級聯放大反應，從而激活信號通路[7-8]。然而，關于性信息素結合蛋白是以何種形式將性信息素分子傳遞給性信息素受體存在3種推測：一為氣味結合蛋白與氣味分子結合在到達受體后將其釋放，氣味分子單獨與神經膜上受體蛋白作用；二為氣味結合蛋白與氣味分子以結合體的形式與氣味受體發生作用；三為氣味結合蛋白將氣味分子運送到神經膜后，先與跨膜蛋白結合而釋放出氣味分子，接著氣味分子再與神經膜上的受體作用[9-11]。但是配基與配體以何種方式與受體的結合及釋放機制尚未明確，相關研究表明它們之間的結合與釋放方式均與氣味分子的構象、嗅覺感器腔內淋巴液的pH值、熱以及神經元膜附近的鹽離子濃度等密切相關[4,12]。

目前很多研究表明PBP功能的發揮與環境的pH相關。在家蠶的研究中發現性信息素結合蛋白可分為還原性和氧化型，當pH 8.2時該蛋白為堿式構型(BmorPBPB)，可以將性信息素運送至受體；當pH 4.5時為酸式構型(BmorPBPA)，可將性信息素從受體釋放出來[13,6]。在動力學研究中證實當信息素被運至神經元樹突膜并同受體結合后，性信息素結合蛋白變成具有清除信息素功能的氧化型。Ziegelberger等[14]通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳發現在多音天蠶蛾中性信息素結合蛋白的氧化態和還原態可以共存。另外，PBPs功能行使與蛋白構象的變化相關聯。在臍橙螟的PBP1的研究中發現當酸堿度從pH 4.5升高到pH 7.0后，N-端α1螺旋為了協調C-端α7螺旋發生約92°的旋轉，自身發生了大約37°旋轉；正是這種結構轉變所造成的擠壓作用使C端形成的第7個α-螺旋進入結合兜內并取代信息素分子的位置，最終將信息素分子逐出以激活性信息素受體[15]。因此，闡明pH對PBPs結構的影響將會使人們深入了解PBPs作用的分子機制。此外，Wojtasek等[16]在家蠶中的研究表明BmoriPBP在pH 5.0～6.0之間構象會發生巨大的變化，即BmoriPBP對pH存在很高的敏感性，但它對于熱以及尿素的變性作用卻具有很高的穩定性。

但Weng等[17]研究發現在中華蜜蜂性信息素氣味結合蛋白ASP1與蜂王信息素HOB的結合關系卻隨著溫度的升高結合力逐漸下降，此研究結果與Wojtasek發現PBP對熱穩定的結果卻顯著不同，可能是由于不同昆蟲之間的分子機制存在的差異造成的，通過光譜分析發現ASP1在結合HOB后親水性會發生一些變化并伴隨著α螺旋的增多。簡言之，PBPs的構象變化受到一些因子的影響，并借助于這些因子變化所提供的能量來完成自身結構的轉變，最終完成對性信息素分子的結合與釋放。

2 信息素結合蛋白作用的關鍵位點

隨著不同昆蟲的PBPs基因被克隆，其功能也逐漸明確。為了深入了解該類蛋白起功能作用的關鍵位點，學者們也進行了不懈的探索。目前研究PBPs與配體之間結合的關鍵位點的方法主要有：圓二色性光譜(Circular Dichroism，CD)、定點突變、同源模建、分子對接、熒光競爭結合試驗等。通過比對多種昆蟲的PBPs序列發現其氨基酸序列中第69位和70位的組氨酸具有高度的保守性。利用圓二色性光譜對多音天蠶的PBPs的研究發現PBP1與性信息素分子4E，9Z-14:Ac結合后蛋白結構會發生顯著的變化，而與6E，1Z-16:Al結合時只有微小的變化；PBP2與6E，11Z-16:Al結合后卻能夠發生明顯的構象變化；然而PBP3卻不能夠與性信息素化合物中的任意一種成分相結合[18]。因此，推測這兩個位點可能與配體誘導PBPs構象的變化有關，隨后利用位點突變試驗證明了組氨酸確實參與了這種構象的變化。在舞毒蛾的研究中利用突變能量計算預測PBPs互作的關鍵位點，并通過表達突變蛋白并結合熒光試驗發現PBP1的第41位的酪氨酸和第76位的苯丙氨酸可能是穩定蛋白結構的關鍵氨基酸；而穩定PBP2蛋白結構的關鍵氨基酸可能是第49位的甘氨酸、76位的苯丙氨酸以及第121位賴氨酸[19]。

根據昆蟲中已鑒定出PBPs基因發現，有些昆蟲中只存在1種PBP，例如家蠶等。有些昆蟲有多種PBPs，例如小地老虎存在3種PBPs，亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)觸角中有PBP4和PBP5的存在[20-22]。這種結果說明：昆蟲中有存在著不同的PBPs可能用來識別不同的性信息素分子。另外，可能尚存在未被發現的PBPs。通過氨基酸序列比對發現，同種昆蟲PBPs之間的序列一致性并沒有同類PBP之間的一致性高，推測可能是由于昆蟲PBP基因有著共同的祖先，由于進化過程中的選擇壓力而出現了分化，從而使得不同PBPs具有識別不同性信息素的功能[23]。關于不同種類的PBPs在棉鈴蟲中的研究發現Harm PBP1與棉鈴蟲的兩種性信息素分子均有很強的結合力，而Harm PBP2和Harm PBP3與這兩種性信息素分子卻僅有很弱的結合能力[24]。進一步試驗發現煙青蟲和棉鈴蟲的3個PBPs分別結合的最佳性信息素分子在C鏈長度上有明顯的區別：PBP1可以與具有13-15個C原子的性信息素較好地結合，而PBP2和PBP3能夠與具有12～14個C原子的性信息素較好地結合[25]。此外，在舞毒蛾的PBP2研究中發現，性信息素分子的羥基和羰基一端適當的鏈長有利于PBPs的結合[26]。相似地，Quan等[27]在飛蝗OBP1的研究中發現該蛋白可以與含15～17個碳原子的醇、酮等化合物有很高的結合力，說明其具有結合長碳鏈的特異性。斜紋夜蛾的3種PBPs中Slit PBP1不能夠與任何一種性信息素分子結合，Slit PBP2與4種性信息素分子均可以較好地結合，然而Slit PBP3與其中2個只存在較弱的結合能力[28]。盡管嗅覺相關蛋白家族基因具有相似的結構，關于PBPs與性信息素分子之間的識別機制已展開廣泛的探索，并且正在深入研究PBPs中起結合作用的關鍵位點，但目前尚未明確地闡明PBPs發揮功能作用的關鍵位點所在。目前雖然關于PBPs的熒光競爭結合實驗研究發現它們可以與某些植物揮發物、性信息素分子類似物以及結構相近的化合物等發生一定程度的結合，但關于這些物質是否能夠真正引起昆蟲的生物學反應，則需要進一步的實驗研究。

3 昆蟲中PBPs不同表達模式

現階段昆蟲PBPs的功能已基本明確，主要有過濾作用、運輸作用、清除作用、性信息素的降解等[29-30]。此外，不少研究也表明在性信息素受體識別性信息素的過程中，PBPs除了載體的功能外，還可以提高性信息素與性信息素受體之間的結合效率，從而促進性信息素與受體之間的反應。昆蟲的各組織部位分布著的豐富感器使昆蟲能夠敏銳地對外界環境做出反應，因此能夠保障昆蟲在不同齡期完成相應的生命活動。與關注昆蟲中不同類的PBPs一樣，雌雄昆蟲之間、不同齡期以及不同組織所表達的PBPs類型同樣引起了研究人員的興趣。

3.1 時間表達特征

昆蟲中PBPs基因的表達高峰期基本都處于成蟲期，而卵期及蛹期僅微量表達，幼蟲期幾乎不表達[31]。例如在桃蛀螟PBP1的研究中發現在其成蟲階段的表達量最高，卵期僅微量表達，幼蟲期和蛹期均沒有檢測到PBP的表達，但在棉鈴蟲PBPs的表達模式研究中發現PBPs在大約羽化前4天便已經開始表達，并能夠在羽化前2天達到高峰；而關于成蟲期，舞毒蛾PBPs的研究結果顯示，PBP1和PBP2在其羽化前4天就已經開始合成，并在隨后的整個成蟲期都持續高表達[32-33]。與此不同的是，在桃蛀螟PBP1的研究中發現4日齡雌蛾觸角中PBP1的表達量是其1日齡表達量的3.4倍[34]。因此，可以推測PBPs主要在昆蟲成蟲期的求偶交配過程中發揮作用。在中華密蜂性信息素結合蛋白(Ac-ASP2)的基因表達譜中發現Ac-ASP2在成蟲期的表達量高峰期與其筑巢、采蜜等行為活動時間比較符合，因此這些活動進行可能與Ac-ASP2的表達相關[35]。雖然不同昆蟲的時間表達譜不盡相同，但這些結果可能暗示著PBPs不同時間的表達與昆蟲在其相應齡期完成生命活動的生物學意義相關。

3.2 不同組織表達特征

昆蟲嗅覺系統所發揮的重要作用主要依賴于觸角，因此大多數嗅覺相關蛋白在觸角中特異性表達。研究表明多數鱗翅目昆蟲的PBPs特異地表達在觸角毛形感受器(sensillatrichodea)中，用來特異性地識別性信息素分子，但隨后在其他昆蟲中的器官如跗節和口器中也偶有發現[36]。對小地老虎PBP1-3的組織表達譜分析發現，小地老虎的3個PBPs雖然在觸角中明顯高表達，在味覺器官的喙及下唇須中存在少量表達，在頭，胸，腹等部位的表達量則非常低[37]。有趣的是，在小菜蛾的研究中發現雌蛾的性腺以及雄蛾的足中也有PBPs基因的表達，這種現象的存在則表明雌蛾可能在識別雄蟲性信息素或檢測自身所釋放性信息素發揮著關鍵的作用[22]。關于足部表達的PBPs基因則可能與雌蛾尋找產卵場所相關：當雌蛾產卵時其性信息素也隨之分泌，而當同種雌蟲在同一寄主的同一部位產卵時，能敏銳地接收到此性信息素信號并轉移至新的寄主，最終避免后代之間的食物競爭以有利于后代的繁衍。

3.3 雌雄二性表達特征

PBPs除具有OBPs的一般特點及能與性信息素特異性結合的功能外，還具有明顯的性二型性。起初研究者們認為PBPs僅在雄性昆蟲觸角中特異性表達，但在隨后的研究中發現雌蟲觸角也存在PBPs，例如小地老虎的3個PBPs在雌蛾觸角的毛形感器中也均有表達[37]，只是大多數都是在雄性昆蟲中的表達量顯著高于雌性。而斜紋夜蛾的PBPs研究發現3個PBPs表達存在顯著的性別傾向，雄蛾主要表達PBP1和PBP2，而雌蛾主要表達PBP3[38]。與之不同的是，煙草天蛾(Manduca sexta)雌雄蛾觸角中的PBPs之間的表達量并沒有差異[28]。因此，PBPs雌雄昆蟲之間除了表達量上的差異之外，所表達的PBPs的基因種類也有所不同。在先前的研究中表明昆蟲中雌蛾釋放的性信息素在空氣中傳播，由雄蛾接受刺激后而發生遠距離的定向飛行并準確定位雌蛾的位置，進而發生求偶交配行為。然而有研究表明雄蟲所釋放的信息素可以顯著增加雌雄昆蟲的交配成功率，當雄蛾接近雌蛾后，便開始釋放雄性信息素抑制雌蛾繼續釋放雌性信息素，這樣可以避免其他同種雄蛾發生求偶行為，從而促進交尾。

4 性信息素結合蛋白與其家族相關蛋白的功能關系

4.1 性信息素結合蛋白與普通氣味結合蛋白之間的關系

目前，研究者已把昆蟲嗅覺相關蛋白研究對象從成蟲轉移到了幼蟲。研究發現當小菜蛾幼蟲在有其主要性信息素分子(Z)-11-十六碳烯存在時，可以對其食物表現出明顯的趨向，說明幼蟲對性信息素分子也具備一定的識別能力；通過免疫細胞化學發現GOBPs在幼蟲期高表達，并且沒有檢測到PBPs基因的表達，進一步的試驗表明GOBPs確實參與了性信息素分子的識別作用[39]。幼蟲所具有的這種嗅覺本能可能是雌蛾所賦予的，這樣使得幼蟲對寄主植物的定向更加敏捷，并可以避免種群之間的食物競爭。在基因進化研究中發現，雖然鱗翅目昆蟲的PBPs與GOBPs之間僅有32%～57%的一致性，但它們卻可以構成一個單系群[40]，并且在家蠶的研究中發現家蠶的PBPs與GOBPs亞家族基因簇中的基因很相似，說明他們很有可能來自同一祖先基因的復制[41-42]。在中華蜜蜂的研究發現ASP1可以與某些植物揮發物結合后在一定程度上可能發揮協同作用[43]。

而在梨小食心蟲的3個普通氣味結合蛋白(OBP)研究中發現GmolOBP8和GmolOBP11既參與寄主揮發物又參與性信息素分子的識別與結合[44]。在甜菜夜蛾普通氣味結合蛋白SexiGOBP2的研究中發現SexiGOBP2對性信息素分子的結合能力較SexiPBP1更強，并且SexiGOBP1-2和SexiPBP1-3均能夠與植物氣味有不同程度的結合，SexiPBP1在性信息素的識別上發揮最重要的功能[45]。另外，在一些研究中發現性信息素結合蛋白還可以與植物揮發物等氣味分子有不同程度的結合，因此，推測PBPs可能有運輸信息素和普通氣味分子的雙重作用[46]。在性信息素的增效劑研究中，也有一些研究者將植物揮發物成分添加到性誘劑中來增強田間害蟲的預測預報及防治作用。

4.2 性信息素結合蛋白與性信息素受體蛋白之間的關系

現階段諸多的研究表明昆蟲在接受氣味分子并完成信號的轉導過程中需要有多種嗅覺相關蛋白的參與，例如性信息素受體(pheromone receptors，PRs)、化學感受蛋白(chemosensory proteins，CSPs)等。其中性信息素受體作為介導化學信號傳遞的基礎，也逐漸地被大家關注。在家蠶與多音天蠶的研究中發現受體神經元的反應依賴于性信息素成分與PBPs，其中PBPs有助于激活受體神經元(Olfactory Receptor Neurons，ORNs)；通過進一步試驗發現PBPs與性信息素分子所形成的復合物不能激活家蠶的受體神經元，但可以激活多音天蠶的受體神經元。因此，也未發現PBPs與受體之間的運輸與識別機制[47]。而在PBPs結合配體后的下游功能研究中發現，一種氣味結合蛋白受體OR可以與多種氣味分子結合，并且同一氣味分子也可被多個受體識別，如此便形成了復雜的編碼譜，其組合關系如圖1[48-49]。并且進一步的研究發現受體蛋白的結合作用與性信息素結合蛋白的類似，諸如在和氣味分子結合時與其C鏈長度相關，因此OR可能與PBPs的構象變化及其結合位點等方面存在相同的機制。

圖1 受體組合代碼[48-49]

5 結論

PBPs最初因其可以特異性地識別性信息素分子而被命名為性信息素結合蛋白，而現在越來越多的研究表明PBPs還可以與植物揮發物、性信息素類似物等結合。在這些研究中通過分子對接等技術方法，盡管可以在化學結構層次上對配基與配體之間的結合方式作出說明，但是這些化學物能否對昆蟲的生物學例如趨避性等方面產生的影響，還有待于進一步的研究。相對來講昆蟲的趨向性更受學者們青睞，自從驅蚊劑應用以來，驅避劑的開發也逐漸進入學者們的研究范疇。之前的研究中發現大蒜精油的成分對許多貯藏害蟲有殺蟲活性，并能夠導致麥蛾的產卵量減少，而進一步研究發現大蒜中的二烯丙基三硫醚(Diallyl Trisulphide，DATS)可能干擾雌麥蛾釋放性信息素而打斷與雄蛾的交配[50-51]。雖然昆蟲的嗅覺蛋白家族存在廣泛的編碼譜給研究者們增加了不少工作量，但同時也提供了新的研究思路。如在性信息素增效劑方面，采用風洞技術發現將植物揮發物成分添加到性誘劑中可以增加蘋小卷葉蛾雄蟲飛向性誘劑的比率，通過實時記錄發現在行為反應上4種植物產品可以縮短蘋小卷葉蛾雄蟲飛向性誘劑的時間[52]。另外，一些氣味結合蛋白及普通氣味結合蛋白也可以與昆蟲的性信息素分子結合，例如，在梨小食心蟲的2個GOBP的結合試驗中發現rGmolGOBP1具有雙重作用既可以與寄主揮發物結合又可以與性信息素分子結合，而rGmolGOBP2則主要參與性信息素分子的識別[53]。

不同昆蟲中存在著不同種類的性信息素分子以及不同數量PBPs，但越來越多的研究表明其主要結合作用只有一種。另外，在有些昆蟲中雌蛾觸角及性腺等組織也同樣存在PBPs，或與雄蟲相同或具有其獨有的PBPs。因此，如果能夠在雌蛾研究中揭示其PBPs的功能及識別機制，將有可能解決目前常用的性誘劑只能誘捕雄蟲的這一缺陷，同時能夠為害蟲的預測預報提供理論基礎。

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Research Progress of the Function of Sex Pheromone Binding Protein in Insects

Tian Zhiqiang,Sun Lina,Li Yanyan,Zhang Huaijiang,Yan Wentao,Yue Qiang,Quan Linfa,Qiu Guisheng
(Institute of Pomology,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Xingcheng 125100,Liaoning,China)

The olfactory system plays an important role in the life of insects.Relying on the olfactory proteins,insects identify the chemical signals released by the environment and internal,accomplish the life activities such as mating and avoid predators.In recent years,many olfactory genes have been identified with the development of transcriptome sequencing technology,and sex pheromone binding protein(PBPs)has been paid much attention by researchers due to its particularity and importance.At present,the rich scientific methods,such as voltage clamp,RNAi,EAG and so on,have made different elaborations on the olfactory protein function,and some new discoveries have been achieved,but there are still some problems to be solved urgently.According to the research progress at home and abroad in recent years,the physical and chemical properties,expression patterns of sex pheromone binding protein and its relationship with other olfactory proteins are reviewed in this paper.

Sex Pheromone Binding Proteins;Antennae;Insects;Olfactory Genes;Function

Q966

A論文編號：cjas16110038

國家自然科學基金“氯蟲苯甲酰胺干擾桃小食心蟲交配的作用機制研究”(31601643)；遼寧省蘋果科技創新團隊“蘋果病蟲害監測及防控崗位”(2014204004)。

田志強，男，1990年出生，河南濟源人，在讀碩士，研究方向：農業昆蟲與害蟲防治。通信地址：125100遼寧省興城市興海南街98號中國農業科學院果樹研究所，E-mail：TianZQCAAS@163.com。

仇貴生，男，1973年出生，遼寧興城人，研究員，研究方向：果樹害蟲防治。通信地址：125100遼寧省興城市興海南街98號中國農業科學院果樹研究所，Tel：0429-3598118，E-mail：guoshu2008@163.com。

2016-11-28，

2017-02-06。