氯化鎘對不同倍性泥鰍鰭細胞系的毒性效應

吳 迪，李 霞,2，秦艷杰,2，白麗雯，李狀狀

（1大連海洋大學，遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，遼寧大連116023；2大連海洋大學，農業部北方海水增養殖重點實驗室，遼寧大連116023）

氯化鎘對不同倍性泥鰍鰭細胞系的毒性效應

吳 迪1，李 霞1,2，秦艷杰1,2，白麗雯1，李狀狀1

（1大連海洋大學，遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室，遼寧大連116023；2大連海洋大學，農業部北方海水增養殖重點實驗室，遼寧大連116023）

旨在研究不同濃度氯化鎘對60～80代二倍體和三倍體泥鰍鰭細胞系（DIMF和TRMF）的毒性效應，比較不同倍性細胞系間的敏感性差異。采用MTT比色法測定半致死濃度，采用酶活力測定法、微核試驗和實時定量PCR法測定了氯化鎘對2種細胞系的細胞毒性和遺傳毒性。結果表明：氯化鎘處理下DIMF、TRMF細胞系半致死濃度分別為(24.0±0.7)、(27.3±1.3)μmol/L。2種細胞系的SOD、GSH-Px活性隨著氯化鎘濃度的增加，呈現先升高后降低的趨勢，而GST活性則表現為逐漸降低。隨著氯化鎘濃度的增加微核率先升高后降低，DIMF、TRMF最大微核率分別為(7.33±0.33)‰、(8.33±0.67)‰。經氯化鎘處理的細胞金屬硫蛋白(MT)表達量顯著增加，30 μmol/L濃度組表達量最大，分別為對照組的55.6和57.6倍。研究表明，氯化鎘對泥鰍二倍體和三倍體細胞系具有細胞毒性和遺傳毒性，且二倍體細胞系較三倍體細胞系對氯化鎘更為敏感。

氯化鎘；泥鰍；細胞系；酶學；微核率；金屬硫蛋白

0 引言

隨著水生環境中重金屬污染問題的日益突出，有關重金屬引起的毒理學研究受到關注。選擇適宜的檢測生物成為毒理學研究的重要內容之一。魚類作為水環境中重金屬污染檢測生物的報道較多[1]。如在中國分布廣泛的泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)，存在著天然的多倍體形態，是良好的急性毒性實驗材料[2-3]。但魚類自身具有排毒和免疫能力，不能敏感地監測出有毒物質[4-6]。體外培養的細胞系具有均一性好、無個體間差異、細胞與污染物直接接觸、反應迅速、觀察方便的特點[7]。Rachlin[8]最早將魚類細胞系用于毒理學實驗，此后不斷有研究者利用不同魚類細胞系探究環芳香族碳水化合物[9]、重金屬[10-12]、除草劑[13]、殺蟲劑[14]、藥物[15]的毒性機理。

鎘是中國水生生態系統中常見的重金屬污染物，是水生動物的非必需元素，目前已知鎘能通過與酶類巰基結合或通過競爭或非競爭性替代作用，置換出細胞內金屬依賴性酶類，特別是抗氧化酶系中的金屬輔基，影響細胞的正常代謝。但鎘對細胞遺傳損傷相關的研究主要是在個體水平所做的工作[16-17]，尚未有利用細胞系進行的研究。筆者以本實驗室建立的二倍體、三倍體泥鰍鰭細胞系為實驗材料，研究了鎘對細胞的毒性效應，為建立適合檢測鎘污染的細胞模型打下基礎，此外還比較了不同倍性細胞系對鎘的敏感性，豐富了魚類多倍體理論研究。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用的泥鰍二倍體鰭細胞系(DIMF)、三倍體泥鰍鰭細胞系(TRMF)是大連海洋大學細胞工程實驗室2012年建立的。細胞系所用的培養基均為含20%胎牛血清的DMEM/F12，25℃，5%CO2條件下培養。

實驗所用DMEM/F12培養基、胎牛血清、胰酶均為Hyclone公司生產；氯化鎘、MTT、DMSO等購置于上海生物工程有限公司；酶學檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；實時定量所用試劑盒來自于北京全式金生物技術有限公司。

實驗在大連海洋大學細胞工程實驗室，于2014年9月—2015年6月進行

1.2 實驗方法

1.2.1 染毒處理 設置氯化鎘濃度分別為0、10、20、30、40、50、60、70、80 μmol/L。取生長良好的 60～80 代DIMF、TRMF，以1×105個/mL密度接種于96孔板或25 mL培養瓶中，接種量分別為0.2 mL和5 mL，24 h后，棄去原培養基，加入等體積含不同濃度氯化鎘的培養基，每個濃度設3個平行，培養24 h后用于實驗。

1.2.2 MTT測定細胞存活率 染毒24 h后，加入40 μL的5 mg/mL的MTT于96孔板中，孵育4 h，棄去培養基，用PBS緩沖液快速清洗2次，加入150 μL DMSO震蕩10 min，在酶標儀570 nm處測定吸光值。其中氯化鎘濃度為0的為陽性對照組，另設一組只加等體積培養基不加細胞的為陰性對照組。細胞存活率計算見公式(1)。

1.2.3 酶活力檢測 收集染毒24 h的細胞于離心管中，1500 r/min離心5 min，用PBS重懸沉淀，在冰水浴中用超聲破碎儀破碎細胞，工作3 s，間隙3 s，處理100次后，按照南京建成試劑盒說明書測定酶活力變化。

1.2.4 微核率測定及統計 收集染毒24 h細胞于離心管中，1000 r/min離心5 min，用0.5 mL PBS重懸沉淀，參考李霞等[18]的方法滴片、推片、甲醇固定、姬姆薩染色、蒸餾水沖洗、自然晾干、中性樹膠封片、油鏡觀察。微核率計算見公式(2)。

1.2.5 金屬硫蛋白測定 以泥鰍Actinβ基因為內參，參照王磊[19]的報道設計引物如下：

收集染毒細胞，1000 r/min離心5 min，用1 mL PBS重懸細胞，然后按照常規TRIzol方法提取細胞總RNA，檢驗RNA完整性、濃度和純度，用DEPC Water調整RNA濃度為500 ng/μL。按照全式金試劑盒說明，反轉錄成cDNA第一條鏈，以反轉錄出來的cDNA為標準品，10倍梯度稀釋為模板，按照全式金說明書，分別制作內參基因Actinβ和目的基因MT的標準曲線，并進行Real-time PCR。另設一組不加cDNA模板，以ddH2O補足的體系為陰性對照。反應體系為：模板1 μL，上下游引物各0.4 μL，2×TransScript?Top Green qPCR SuperMix 10 μL；Passive Reference Dye(50×)0.4 μL；ddH2O 7.8 μL。反應條件為：94℃ 30 s；94℃ 5 s，60℃ 30 s，40循環，結果以ΔΔCt法計算。

1.2.6 數據處理 實驗數據用SPSS 17.0軟件分析，結果以平均值±標準差表示，P＜0.05定義為差異顯著，P＜0.01定義為差異極顯著，用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 半致死濃度的確定

以不同濃度的氯化鎘處理泥鰍鰭細胞系24 h后，存活率變化如圖1。從圖1中可以看出2種細胞變化規律基本一致，隨著氯化鎘濃度的增加，細胞存活力逐漸降低，細胞存活率與染毒濃度有依賴關系，存活率與濃度的自然對數劑量效應方程分別為：y=-45.24lnx+193.87(R2=0.984)和y=-45.97lnx+198.67(R2=0.986)，根據方程可知DIMF的半致死濃度為(24.0±0.7)μmol/L，當濃度達到70 μmol/L時全部死亡；TRMF的半致死濃度為(27.3±1.3)μmol/L，當濃度達到80 μmol/L時全部死亡。

圖1 氯化鎘對DIMF、TRMF存活率的影響

2.2 酶活力變化

不同濃度的氯化鎘處理細胞系24 h后SOD活性變化如圖2，當氯化鎘濃度為0～20 μmol/L時，DIMF和TRMF細胞系的酶活性隨染毒濃度的增加而升高，20 μmol/L氯化鎘濃度組SOD活性最高，分別為40.5、50.6 U/mg prot，與對照組存在極顯著差異(P＜0.01)，相同染毒濃度，TRMF的SOD活性要高于DIMF。

圖2 不同濃度氯化鎘處理DIMF、TRMF的SOD活性

氯化鎘處理24 h后GSH-Px活性變化如圖3，GSH-Px活性隨氯化鎘濃度的升高，呈現先升高后降低的趨勢，10 μmol/L氯化鎘濃度組GSH-Px活性最高，分別為43.7、68.8 U/mg prot，與對照組存在極顯著差異(P＜0.01)。GSH-Px的活力順序為DIMF＜TRMF。

圖3 不同濃度氯化鎘處理DIMF、TRMF的GSH-Px活性

染毒24 h后，隨著氯化鎘濃度的逐漸升高，2種細胞的GST活性均呈現降低的趨勢，見圖4。

圖4 不同濃度氯化鎘處理DIMF、TRMF的GST活性

2.3 微核率的變化

經氯化鎘處理后，DIMF、TRMF中均有微核出現，微核顏色與細胞核相同，呈圓形（圖5）。由表1可見，當氯化鎘濃度在0～30 μmol/L時，DIMF的微核率隨鎘濃度的升高而升高，當氯化鎘濃度為30 μmol/L時，微核率達到最大，為7.33‰；當氯化鎘濃度在0～40 μmol/L時，TRMF的微核率隨鎘濃度的升高而升高，當氯化鎘濃度達到40 μmol/L時，微核率達到最大，為8.33‰。氯化鎘濃度相同的情況下，DIMF微核率低于TRMF。

圖5 氯化鎘處理DIMF(A)、TRMF(B)細胞核的形態

表1 不同濃度氯化鎘對DIMF和TRMF微核率的影響

2.4 MT表達量的變化

MT mRNA相對表達量的實驗結果見圖6。泥鰍鰭細胞系MT在無重金屬刺激下表達量很低，10 μL的氯化鎘就可刺激MT mRNA大量表達(P＜0.01)，在氯化鎘濃度為30 μL達到最大值(P＜0.01)，分別為對照組的55.6、57.6倍，此后表達量有所下降，但仍極顯著高于對照組(P＜0.01)。2個細胞系間沒有顯著性差異。

3 結論

利用MTT法得出了泥鰍二倍體和三倍體細胞系對氯化鎘的半致死濃度，表明兩個細胞系對氯化鎘比較敏感。較低濃度(0～20μmol/L)的氯化鎘可以激活2種細胞系的抗氧化系統，也會導致微核率的升高，金屬硫蛋白表達量升高，但高濃度的氯化鎘則超出了抗氧化系統所能調節的范圍，也會直接導致細胞死亡，金屬硫蛋白表達量隨即下降。綜合來看，氯化鎘處理下，二倍體較三倍體細胞系更為敏感。

圖6 經不同濃度氯化鎘處理后MT相對表達量

4 討論

4.1 氯化鎘對細胞存活率的影響

本實驗中DIMF、TRMF半致死濃度為(24.0±0.7)、(27.3±1.3)μmol/L，與譚鳳霞等[12]報道的氯化鎘對稀有鮈卿鰭條細胞系的半致死濃度(23±4.4)μmol/L相近，說明實驗中所用的二倍體、三倍體細胞系對氯化鎘的反應比較敏感，可用于鎘污染的監測以及毒理學研究。

4.2 氯化鎘對抗氧化酶活力的影響

Cd2+可以改變抗氧化酶的活力，降低細胞對自由基及其產物的清除能力[19]。SOD是細胞中關鍵的抗氧化酶，可清除重金屬誘導的氧自由基，從而保護細胞。當鎘濃度較低時，細胞自身抗氧化酶活性增大清除活性氧，當超過一定范圍后，Cd2+可置換SOD中的Zn2+，改變SOD的構象，使細胞抗氧化酶系統受損嚴重，從而導致SOD活力降低，所以Cd2+是SOD的抑制劑[20]。本實驗中發現當氯化鎘濃度為0～20 μmol/L時，二倍體和三倍體細胞系的酶活性隨染毒濃度的增加而升高，20 μmol/L氯化鎘濃度組SOD活性最高，以后逐漸降低，與孫淑紅等[21]研究結果相似。

谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px廣泛存在于生物體內，能特異地催化還原型谷胱甘肽(GSH)與H2O2反應，是有機體分解過氧化氫的關鍵酶，可起到保護細胞膜的作用。實驗結果顯示，2種細胞系在低濃度鎘處理時，GSH-Px活性略有升高，可能是SOD作用時可產生大量的過氧化氫，因此GSH-Px活力升高，而GSH-PX的結構中含有硒，高濃度Cd2+與硒形成復合物，破壞其活性部位，使GSH-PX活力降低。

GST是生物體內重要的代謝酶，存在于各種組織細胞中，具有消除自由基和解毒的雙重功能[22]，催化谷胱甘肽與可溶性脂質物結合，能防止脂質的過氧化。生物體的GST對污染物脅迫十分敏感，其活性變化可以反映污染物脅迫下的氧化應激反應[23]。較多的研究結果是低濃度的污染物引起GST活性升高，而高濃度下GST活性降低[22]，也有報道GST活性隨染毒濃度的升高而降低[24]。本研究中發現2種細胞系中GST活力均隨鎘濃度的增加而降低，其原因可能與暴露時間、污染物類型及濃度劑量有關。

4.3 氯化鎘引起細胞微核率的改變

近年來，泥鰍紅細胞微核率的變化已作為監測水環境污染的一個重要指標[25-26]。微核是染色體斷裂的片段或有絲分裂后期滯留的染色單體，類似細胞核，但體積較小[26]。Cd2+在細胞中破壞染色體，使其斷裂，丟失，從而形成微核。本實驗結果表明在較低濃度時微核率與鎘濃度呈正相關，而后隨著濃度升高，微核率反而降低，其原因可能是由于鎘濃度過高時，抑制細胞分裂或使細胞核完全裂解，從而微核率降低。

4.4 氯化鎘對MT基因表達的影響

金屬硫蛋白(MT)是一類具有結合金屬離子的蛋白質[27]，可在轉錄水平上被重金屬誘導大量表達，螯合過量的重金屬離子，降低重金屬對細胞的毒害作用，被認為是指示水污染的標志生物。本實驗中發現泥鰍鰭細胞系MT在無氯化鎘刺激時表達量很低，與王磊[18]所做的泥鰍MT基因在鰭組織表達結果相符；Cheuk等[28]曾發現，鎘可誘導斑馬魚MT表達量升高，本實驗中將細胞系暴露于氯化鎘后，MT會大量表達，兩者結果一致；并且2種細胞均表現出先升高后降低的變化規律，可能是當鎘濃度超過一定量時，細胞受損嚴重，各項機能顯著降低，導致金屬硫蛋白表達量下降。

4.5 二個細胞系間的比較

從半致死濃度來看，二倍體細胞系(24.0±0.7 μmol/L)低于三倍體(27.3±1.3μmol/L)，說明二倍體細胞系對鎘更為敏感。而酶學和微核率的變化規律均為DIMF＜TRMF。三倍體細胞比二倍體細胞大，細胞中各種物質相對較多[2]，利于酶的生成，以抵抗外界不良環境，從而顯示更高的抗耐性，因此酶活力略高于二倍體。三倍體細胞核比二倍體細胞核大，染色體數目增多，從而細胞核受到損傷的幾率也相應增加，因此三倍體細胞系微核率大于二倍體細胞系。2種細胞間MT的表達量未出現顯著性差異，細胞中MT的表達是一個十分復雜的過程，其具體的表達方式還有待進一步的研究。

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Cytotoxicity of Cadmium Chloride to Loach Fin Diploid and Triploid Cell Lines in Vitro

Wu Di1,Li Xia1,2,Qin Yanjie1,2,Bai Liwen1,Li Zhuangzhuang1
(1Key Laboratory of Marine Bio-resource Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,Liaoning,China;2Key Laboratory of Mariculture,Ministry of Agriculture,PRC,Dalian Ocean University,Dalian 116023,Liaoning,China)

In this study,60-80 generation of loach fin diploid cell line(DIMF)and triploid cell line(TRMF)were used to assess toxicity of cadmium chloridein vitro,and the toxicity characteristics between different ploidies were compared.Semi-lethal concentrations were determined with MTT method;cytotoxicity and genotoxicity were studied through enzyme activity test,micronucleus rate test,and real-time quantitative PCR.Results showed that semi-lethal concentration of DIMF and TRMF was 24.0±0.7 μmol/L and 27.3±1.3 μmol/L,respectively.Activities of SOD and GSH-Px firstly increased,and then decreased.The activity of GST decreased progressively with the increase of cadmium chloride concentration.Micronucleus rates increased firstly and then decreased with the increase of cadmium chloride concentration,and the maximum micronucleus rate of DIMF and TRMF was 7.33±0.33‰ and 8.33±0.67‰,respectively.Relative expression level of MT significantly increased when DIMF and TRMF were exposed by cadmium chloride.The maximum expression levels(55.6 and 57.6 folds of those in control)occurred when cadmium chloride concentration was 30 μmol/L.All results indicated that cytotoxicity and genotoxicity could be detected in DIMF and TRMF subjected to cadmium chloride,and DIMF was more sensitive to cadmium chloride than TRMF.

Cadmium Chloride;Misgurnus anguillicaudatus;Cell Line;Enzyme Activity;Micronucleus Rate;Metallothionein

Q256

A論文編號：cjas16110016

國家自然科學基金項目“泥鰍雜交三倍體染色體組穩定性及其表觀遺傳機制解析”(31272650)。

吳迪，女，1991年出生，碩士研究生，主要從事重金屬污染及細胞培養的研究。通信地址：116023大連市沙河口區黑石礁街52號，Tel：0411-84763519，E-mail：15842623565@163.com。

李霞，女，1961年出生，江蘇南京人，教授，碩士，主要從事水產生物技術研究。E-mail：lx@dlou.edu.cn。

2016-11-11，

2017-03-06。