安眠小復方對小鼠促眠作用的機制研究

甘 雨 喬 敏 張 宏△ 范英蘭 趙晶鳳 劉小虎 包玉龍 武曉琳

1)遼寧省中醫藥研究院，遼寧 沈陽 110034 2)沈陽二四二醫院，遼寧 沈陽 110034

安眠小復方對小鼠促眠作用的機制研究

甘 雨1)喬 敏1)張 宏1)△范英蘭1)趙晶鳳2)劉小虎1)包玉龍1)武曉琳1)

1)遼寧省中醫藥研究院，遼寧 沈陽 110034 2)沈陽二四二醫院，遼寧 沈陽 110034

目的探討中藥安眠小復方對小鼠腦神經肽P物質(SP)及睡眠相關細胞因子的影響，以揭示其促眠作用機制。方法60只KM小鼠隨機分為6組，安眠小復方高、中、低劑量組分別灌胃給予安眠小復方4.16 g/kg，2.08 g/kg，1.04 g/kg，百樂眠組灌胃給予百樂眠膠囊0.28 g/kg，地西泮組灌胃給予地西泮片1.30 mg/kg，連續給藥7 d。末次給藥30 min后，處死動物，取腦組織，檢測小鼠腦內神經肽SP、白介素1β (IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量。結果與空白對照組比較，安眠小復方高、中、低劑量組均能明顯降低小鼠腦組織中SP含量(P<0.05或P<0.01)和IL-1β含量(P<0.01)；安眠小復方高、中、低劑量組亦能降低小鼠腦組織中TNF-α含量，其中高、低劑量組與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。結論中藥安眠小復方可能通過降低腦內SP含量、破壞覺醒中樞同時調節睡眠相關細胞因子而發揮促眠作用。

失眠；中藥復方；P物質；白介素1β；腫瘤壞死因子α

隨著現代社會生活節奏的日益加快及不健康生活方式的增多，越來越多的人患上了失眠癥(包括入睡困難、易醒、早醒等)，長期失眠可使大腦感覺和智力的敏感度下降，甚至引起抑郁及其他精神類疾病[1]。因此，尋求有效的治療藥物迫在眉睫。以安定為代表藥雖能起到鎮靜安眠作用，但需長期服藥，并有一定的不良反應，增加了患者的心理負擔。中藥安眠小復方是由遼寧中醫藥大學附屬二院院內制劑安眠顆粒(2005年獲國家發明專利，由黃芩、苦參、石菖蒲等5味中藥組成)經組方精簡與劑量優化篩選出的新一代復方制劑，其療效和安全性已得到課題組前期實驗驗證[2-3]。本實驗在此基礎上對睡眠相關神經遞質和細胞因子進行了研究，旨在進一步揭示其促眠作用神經機制。

1 材料和方法

1．1實驗動物昆明種小鼠，SPF級，體質量18～22 g，雌雄各半，由遼寧長生生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(遼)2010-0001。受試動物引進后在遼寧省中醫藥研究院實驗動物中心(許可證號：SYXK(遼)2012-0010)飼養。

1．2藥物與試劑安眠小復方由遼寧省中醫藥研究院藥學室提供，批號：20131023；百樂眠膠囊，揚子江藥業集團有限公司，批號：13012412；地西泮片，上海信誼藥廠有限公司，批號：121201；磷酸鹽緩沖液(PBS)，無錫傲銳東源生物科技有限公司，批號：150706。P物質(SP)酶聯免疫試劑盒(批號：201506)、白介素1β (IL-1β) 酶聯免疫試劑盒(批號：201506)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯免疫試劑盒(批號：201506)均購于美國R&D公司。

1．3儀器SPECTRA MAX 190型酶標儀，美國Molecular Devices公司；XW-80A型漩渦混勻器，上海瀘西分析儀器廠；SIGMA 3-18k型低溫離心機，德國SIGMA公司；JKDP-2型電熱恒溫培養箱，廈門醫療電子儀器廠。

1．4方法

1．4．1 分組與給藥：取健康SPF級昆明種小鼠60只，按體質量隨機分為6組，即空白對照組，安眠小復方高、中、低劑量組，百樂眠組和地西泮組，每組10只。安眠小復方高、中、低劑量組分別灌胃給予安眠小復方4.16 g/kg，2.08 g/kg，1.04 g/kg，百樂眠組灌胃給予百樂眠膠囊0.28 g/kg，地西泮組灌胃給予地西泮片1.30 mg/kg，空白對照組灌胃給予同體積的蒸餾水。連續灌胃給藥7 d。

1．4．2 取材：于末次灌胃給藥(水)30 min后，將小鼠斷頭處死，快速取腦組織，除去小腦及延髓，用冷PBS沖洗腦組織表面，再用濾紙吸干，備用。

1．4．3 檢測：取腦組織稱質量，加9倍量的冷PBS手動勻漿，4 ℃ 15 000 r/min離心10 min，取上清液，按各試劑盒操作步驟處理后，用酶標儀在450 nm波長下依序測量各孔的吸光度(OD值)。采用外標法繪制標準曲線，計算樣品的實際濃度。

2 結果

2．1安眠小復方對小鼠腦組織中P物質含量的影響以標準品的濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪制標準曲線，計算直線回歸方程為：Y=-0.001 69+0.028 8x(R2=0.969)根據回歸方程計算各組樣品中P物質含量。見表1。結果表明，安眠小復方高、中、低劑量組均能明顯降低小鼠腦組織中P物質含量，與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。

表1 安眠小復方對小鼠腦組織中P物質含量的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

2．2安眠小復方對小鼠腦組織中IL-1β含量的影響以標準品的濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪制標準曲線，計算直線回歸方程為：Y=0.174+0.063 7x(R2=0.912)根據回歸方程計算各組樣品中IL-1β含量。見表2。結果表明，安眠小復方高、中、低劑量組均能明顯降低小鼠腦組織中IL-1β含量，與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

2．3安眠小復方對小鼠腦組織中TNF-α含量的影響以標準品的濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪制標準曲線，計算直線回歸方程為：Y=0.240+0.008 78x(R2=0.983)根據回歸方程計算各組樣品中TNF-α含量。見表2。結果表明，安眠小復方高、中、低劑量組均能降低小鼠腦組織中TNF-α含量，其中高、低劑量組與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 安眠小復方對小鼠腦組織中IL-1β、NF-α含量的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

睡眠的作用機制十分復雜，是一種多系統、多途徑、多因子的調節過程，而中藥復方具有多成分、多途徑、多靶點的作用特點，我們從神經肽P物質和細胞因子兩方面著手，探討安眠小復方改善睡眠的作用機制。

P物質屬于一種神經肽類，在中縫核、下丘腦、藍斑、皮質等部位均有分布，與痛覺調制、心血管活動和胃腸道運動密切相關。近年來，有研究發現其作為內源性物質參與了睡眠—覺醒的調節，特別是在促進覺醒方面發揮了重要作用。Andersen等[4]發現從小鼠側腦室注射P物質，可顯著增加藍斑區神經元放電，進而導致小鼠睡眠紊亂，覺醒時間延長。Lieb等[5]也發現，健康成人靜脈注射P物質可抑制睡眠。本研究中，健康小鼠連續7 d給予安眠小復方后，其腦組織中P物質含量明顯降低，與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。提示安眠小復方可能是通過降低腦內P物質含量，破壞覺醒中樞，而發揮促進睡眠作用的。

大量臨床和實驗研究結果表明，細胞因子參與了睡眠活動，是睡眠的重要調節因子之一，其中與睡眠調節關系最為密切的是IL-1β和TNF-α[6]，但具體的調節方向還存在一些爭議。有學者研究發現，人為靜脈注射(或腦室注射) IL-1β和TNF-α可促進鼠、貓、兔等多種動物自發性睡眠，腦電圖顯示慢波睡眠時間延長[7]。在對睡眠剝奪動物研究中發現，IL-1β和TNF-α在其腦干、下丘腦內的表達水平均顯著升高[8]。在對臨床睡眠障礙患者研究中，也發現其血清IL-1β和TNF-α水平升高[9]，給予安眠藥物后，IL-1β和TNF-α顯著降低。國內對四逆散[10]、棗仁安神顆粒[11]等改善睡眠藥物研究也發現，促進睡眠藥物可降低全腦IL-1β和TNF-α含量，與本研究結果一致。提示安眠小復方可能通過降低腦組織中IL-1β和TNF-α含量而發揮改善睡眠作用。

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(收稿2017-02-08)

責任編輯：關慧

Studyonthemechanismofsleepofanti-insomniaChineseherbalcompoundinmice

GanYu*，QiaoMin，ZhangHong，FanYinglan，ZhaoJingfeng，LiuXiaohu，BaoYulong，WuXiaolin

*LiaoningInstituteofTraditionalChineseMedicine，Shenyang110034，China

ObjectiveTo explore the effect of anti-insomnia Chinese herbal compound on the brain neuropeptide substance P (SP) and sleep related cytokines in mice，in order to reveal its mechanism．MethodsSixty KM mice were randomly divided into 6 groups．The mice in anti-insomnia Chinese herbal compound high，middle and low dose groups were given intragastric Chinese herbal compound 4.16 g/kg，2.08 g/kg and 1.04 g/kg；the mice in Bailemian group were given intragastric Bailemian capsule 0.28 g/kg；the mice in Diazepam group were given intragastric Diazepam tablets 1.30 mg/kg.All groups were administered continuously for 7 days．30 min after the last administration，the mice were killed and the contents of neuropeptide SP，interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in the brain were detected．ResultsCompared with the blank control group，the high，middle and low dose groups of anti-insomnia Chinese herbal compound could obviously decrease the content of SP (P<0.05 orP<0.01) and IL-1β (P<0.01) in the brain tissue of mice．The high，middle and low dose groups of anti-insomnia Chinese herbal compound could also reduce the content of TNF-α in the brain tissue of mice，and the difference was statistically significant between high，low dose groups and control group (P<0.05)．ConclusionAnti-insomnia Chinese herbal compound may be through reducing the content of SP in the brain，damage to the central nervous system，while regulating sleep related cytokines，and play a role in promoting sleep．

Insomnia；Chinese herbal compound；Substance P；IL-1β；TNF-α

R-332

A

1673-5110(2017)19-0029-03

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.19.006

遼寧省科技廳自然科學基金 (No：201602442)

△通信作者：張宏，女，研究員。研究方向：中藥復方藥理學。Email：zhanghong8163@163.com