飼料中添加干酪乳桿菌對鯉魚非特異性免疫力和抗病力的影響

張海朋 ， 谷 巍 ， 鞠安琪 ， 畢建飛 ， 曲 磊 ， 成 璐 ，陳 龍 ， 康元環 ， 單曉楓 ， 錢愛東

(1.吉林農業大學動物科學技術學院 ， 吉林長春130118 ； 2.山東寶來利來生物工程股份有限公司 ， 山東泰安271000)

飼料中添加干酪乳桿菌對鯉魚非特異性免疫力和抗病力的影響

張海朋1， 谷 巍2， 鞠安琪1， 畢建飛1， 曲 磊1， 成 璐1，陳 龍1， 康元環1， 單曉楓1， 錢愛東1

(1.吉林農業大學動物科學技術學院 ， 吉林長春130118 ； 2.山東寶來利來生物工程股份有限公司 ， 山東泰安271000)

為探討飼料中添加干酪乳桿菌對非特異性免疫力和抗病力的影響，在基礎飼料中分別添加3種不同濃度1×107CFU/g、1×108CFU/g、1×109CFU/g的干酪乳桿菌，養殖初始體重為(28±0.3)g的鯉魚6周。結果顯示，與對照組相比，飼料中添加1×108CFU/g時超氧化物歧化酶(SOD)和抗體IgM含量顯著升高(P<0.05)，但1×109CFU/g的SOD活力和抗體IgM含量反而受抑制；在28 d時添加量為1×108CFU/g的溶菌酶(LZM)和過氧化物酶(POD)活力最高，1×107CFU/g、1×109CFU/g的低一些，均高于對照組；而試驗各組中堿性磷酸酶(AKP)活力隨干酪乳桿菌濃度的增加而升高。飼喂后第42天以菌株維氏氣單胞菌TH0426攻毒，各組14 d后的累積死亡率差異顯著(P<0.05)，與對照組相比，添加1×108CFU/g的干酪乳桿菌免疫保護率最高為60%，1×107CFU/g、1×109CFU/g的次之。由此可見，在基礎飼料中添加1×108CFU/g的干酪乳桿菌能提高鯉魚的非特異性免疫力，且具有較高的免疫保護效果。

干酪乳桿菌 ； 鯉魚 ； 酶活力 ； 免疫效果

干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)屬于乳桿菌屬(Lactobacillus),革蘭陽性菌,研究報道干酪乳桿菌對動物宿主具有顯著益生作用，能夠排斥有害微生物,改善腸道微生物菌群和上皮細胞完整性，增強機體免疫反應等作用[1]，飼料中添加干酪乳桿菌有望能提高魚類的細胞免疫水平,改善腸道微生物環境。

在我國，鯉魚養殖規模逐年擴大，但病害的頻發制約了魚類養殖產業的發展。目前，由于抗生素的耐藥性以及疫苗的價格過高和使用不便等因素，致使其應用受限[2]，而乳酸菌制劑因使用方便，價格合理，在養殖業中廣泛使用，因而可能成為目前有效控制魚病的一種重要手段。魚類的非特異性免疫是魚類抵抗病原微生物感染的重要手段，其吞噬和免疫相關酶類起主要作用。堿性磷酸酶(AKP)廣泛存在于魚類的血液、組織和器官等部位，對魚類的生長發育及免疫機制起到至關重要的作用；超氧化物歧化酶(SOD)是一種重要的抗氧化酶，能夠清除體內多余的氧自由基；過氧化物酶(POD)能促進細胞呼吸，提高粒細胞對外源異物的吞噬能力。抗體IgM是魚類特異性體液免疫應答中最主要的介質,其含量的高低與機體的免疫能力密切相關。因此，探究魚體內非特異性免疫和抗病力對魚類免疫機制的研究具有重要意義。本文選用鯉魚為試驗動物，以飼料中添加不同濃度的干酪乳桿菌進行投喂飼養，分析其對LZM、AKP、SOD和POD酶活力變化和抗體IgM含量及抗病力的影響，為干酪乳桿菌在鯉魚飼料中的合理應用提供理論應用。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株及動物 干酪乳桿菌C20028株、維氏氣單胞菌TH0426株由吉林農業大學預防獸醫實驗室保存。健康鯉魚，購自長春某養殖場，暫養 15 d，觀察健康無癥狀后用于試驗。

1.2 主要試劑及器材 MRS瓊脂，購自北京陸橋生物技術責任有限公司；30 ℃電熱恒溫培養箱，電熱鼓風干燥箱，基礎飼料選自山東省原味寵糧源自天然公司生產的鯉魚全價配合粒狀飼料(粗蛋白34%、粗脂肪5.0%、粗纖維8.0%)。LZM、AKP、SOD以及POD和抗體IgM含量檢測試劑盒，購自美國TSZ生物公司；Sigma高速臺式冷凍離心機。

1.3 細菌培養及干酪乳桿菌飼料添加劑制備 干酪乳桿菌C20028在MRS平板劃線30 ℃厭氧過夜培養后，接種單菌落于MRS液體培養基30 ℃厭氧過夜培養。平板計數后用于飼料添加劑的制備。

干酪乳桿菌飼料添加劑的制備參考李卓佳等(2003)方法略有改動制備干酪乳桿菌飼料添加劑。具體如下：干酪乳桿菌C20028接種在MRS液體培養基中 30 ℃過夜厭氧培養，菌懸液5 000 r/min(4 ℃)離心15 min,棄去上清，并加入等量無菌PBS，反復離心3次后平板計數干酪乳桿菌的菌液濃度，以無菌PBS調整菌液濃度為1×107、1×108、1×109CFU/g后將菌液均勻的噴灑到基礎飼料中，再將噴灑過干酪乳桿菌的飼料放到恒溫40 ℃的烘干箱中烘干，直至飼料變干，同時取少部分烘干的飼料進行菌落計數，驗證飼料中干酪乳桿菌的菌液濃度也為1×107、1×108、1×109CFU/g。放到4 ℃冰箱保存備用。

1.4 飼養管理 選擇240尾體重為(28±0.3)g，體態正常,健康無病的鯉魚，將240尾暫養后的鯉魚隨機分為4組，作為對照組和3種基礎飼料中添加干酪乳桿菌的濃度為1×107、1×108、1×109CFU/g的3個組，每組做3個重復組，每個重復組20尾魚，全程水溫為25℃±1℃，試驗前兩周使用基礎飼料進行馴化，待魚穩定后開始以組為單位投喂添加不同濃度干酪乳桿菌的基礎飼料，每天投喂3次，試驗各組投喂添加不同濃度的干酪乳桿菌飼料7 d后，投喂不添加干酪乳桿菌的基礎飼料7 d，然后再投喂含干酪乳桿菌的飼料，以此類推，其余時間均投喂不含干酪乳桿菌的基礎飼料，而對照組始終投喂基礎飼料，試驗期為6周。

1.5 血清樣品采集 在養殖第0天、7天、14天、21天、28天、35天、42天時，每組隨機抽取3尾魚。用10%丁香油麻醉，采用尾靜脈采血法抽取鯉魚血液置于 5 mL滅菌離心管中，分組標號，在室溫下放置1 h后，置于4 ℃冰箱中過夜，待血清充分析出后以3 500 r/min 離心15 min,制得血清，-40 ℃保存。

1.6 酶活力檢測 血清中LZM,AKP,POD和SOD酶活力和抗體IgM含量的測定，均采用美國TSZ生物公司提供的檢測試劑盒，相應操作按說明書進行。酶活力單位各說明書已標明。

1.7 攻毒試驗 試驗用維氏氣單胞菌TH0426來自本實驗室保存，菌液用LB液體培養在30 ℃培養箱中培養24 h，用滅菌生理鹽水清洗，集菌，6 000 r/min 離心15 min，收集沉淀細菌體，反復洗菌3次后，進行梯度稀釋，確定適宜攻毒濃度(1×106CFU/mL)后，置4 ℃冰箱保存備用。養殖試驗結束后，每組取20尾魚進行攻毒試驗，每尾腹腔注射維氏氣單胞菌TH0426 0.2 mL，每組繼續投喂試驗飼料飼養，計算14 d的累積死亡情況，計算存活率。

1.8 數據分析 利用SPSS 16.0數據分析軟件進行單因素方差分析, 結果用平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 血清中LZM、SOD、AKP、POD酶活力變化 從圖1可以看出，試驗各組LZM活力與對照組相比，在飼喂后都逐漸上升，其中1×108CFU/g的LZM活力在28 d為最高，達到0.578 IU/L,差異極顯著(P<0.01)，并在35 d和42 d保持穩定，而1×107CFU/g和1×109CFU/g組中LZM活力較低，但仍高于對照組水平。

從圖2可以看出，1×107CFU/g、1×108CFU/g組中SOD活力在28 d時活力最顯著，而在28、42 d時1×109CFU/g組對SOD的活力具有抑制作用。

從圖3可以看出，1×107CFU/g、1×108CFU/g和1×109CFU/g組中血清AKP活力顯著下降(P<0.05)，但在28 d～42 d時AKP活力都上升，其中1×109CFU/g組中AKP活力上升最高，隨后基本穩定。

從圖4可以看出，試驗各組POD活力在飼喂前后基本無變化，但在第14天時都趨于上升，且1×108CFU/g組POD活力均高于1×107CFU/g和1×109CFU/g組，各組在隨后第28～42天趨于穩定。

圖1 飼喂后各組血清LZM活力變化

圖2 飼喂后各組血清SOD活力變化

圖3 飼喂后各組血清AKP活力變化

圖4 飼喂后各組血清POD活力變化

2.2 血清中抗體IgM含量的檢測 飼喂不同濃度的干酪乳桿菌后1×107CFU/g和1×108CFU/g組中IgM含量隨濃度增加而升高(P<0.05)，而1×109CFU/g組中IgM含量出現抑制現象，可見飼喂過高濃度的干酪乳桿菌可抑制IgM的生成。

2.3 免疫保護力檢測結果 免疫后第42天以維氏氣單胞菌TH0426進行攻毒試驗，對照組從第1天和第2天開始出現大量死亡，在第6天死亡率達到100%。1×107CFU/g、1×108CFU/g和1×109CFU/g組在攻毒后5 d死亡數量逐減，在第7天以后沒有死亡情況，觀察14 d后，根據公式計算出1×107CFU/g、和1×109CFU/g組的相對免疫保護率 RPS 為45%和35%，而1×108CFU/g組的相對免疫保護率 RPS 最高為60%，試驗組及對照組在攻毒后鯉魚具體死亡數量可見圖6

3 討論

非特異性免疫系統是魚類的基本防御機制，在抗病力上比特異性免疫系統更重要。溶菌酶(LZM)可以協調其他免疫因子共同抵制病原的入侵，是衡量免疫功能及機體狀態的指標[3]。本試驗各組血清中LZM活力穩定升高,均高于對照組水平，且1×108CFU/g組在第28天達到最高值，之后呈下降趨勢，這與王雷[4]報道的試驗結果相似,表明干酪乳桿菌可以提高鯉魚血清中LZM活力，進而增強對外源微生物侵染的防御能力。

圖5 飼喂后各組血清IgM含量變化

圖6 菌株維氏氣單胞菌TH0426攻毒后的存活曲線

超氧化物歧化酶(SOD)是一種重要的抗氧化酶，能使動物免除自由基造成的危害。本文中1×107CFU/g、1×108CFU/g組SOD活力顯著提升，而1×109CFU/g組的SOD活力受抑制，此結果與冼健安[5]等報道的基本一致，據此推測所用的干酪乳桿菌在低濃度時對SOD活力具有促進作用。

堿性磷酸酶(AKP)是重要的解毒體系，可增強機體對病原的識別和吞噬能力，是衡量機體免疫功能的重要指標之一。本試驗各組AKP活力在早期階段呈下降趨勢，但在第28天，各試驗組AKP活力出現上升趨勢，隨后趨于穩定。這與譚初斌[6]等研究結果相似，表明飼喂干酪乳桿菌后可改善鯉魚血清中AKP活力。

過氧化物酶(POD)屬抗氧化酶類,在體內分解H2O,對體內氧自由基的清除具有重要作用，可以提高機體的解毒功能和防病抗病能力。本試驗中，各組POD活力在7 d、14 d時基本無變化，但到28 d時POD活力上升，且1×108CFU/g組POD活力最高，到35 d、42 d時趨于穩定。這可能是適當濃度的干酪乳桿菌提高了POD活力。

在體液免疫中，抗體IgM的合成可抵御外源異物的入侵，因此抗體IgM含量可作為評價魚類免疫強弱的重要指標。本試驗中，1×107CFU/g、1×108CFU/g組的IgM含量上升，而1×109CFU/g組的IgM含量處于較低水平。因此，我們發現飼喂低濃度的干酪乳桿菌能促進IgM生成，而高濃度反而抑制IgM生成。這與李春翠[7]試驗結果相一致，表明適當濃度的干酪乳桿菌能促進鯉魚產生IgM免疫球蛋白。

攻毒試驗顯示，1×108CFU/g組的相對免疫保護率最高為60%，表明飼喂添加1×108CFU/g的干酪乳桿菌能提供一定的保護力，充分證實干酪乳桿菌能顯著提高鯉魚的抗病能力。

綜上所述，飼料中添加1×108CFU/g的干酪乳桿菌能提高鯉魚血清中LZM、SOD、AKP、POD酶活力和IgM含量，并提供了一定的保護力，進而增強了鯉魚的非特異性免疫，本研究結果為魚類口服疫苗的研制提供了重要參考。

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[3] 章 蔚. 一株益生乳酸菌的分離鑒定、生物學特性及其對黑鯛腸道、血清的影響[D].杭州：中國計量學院,2012.

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Effects of non-specific immunity and disease resistance of feeding Lactobacillus casei on common carp

ZHANG Hai-peng1， GU Wei2, JU An-qi1， BI Jian-fei1， QU Lei1， CHENG Lu1， CHEN Long1， KANG Yuan-huan1， SHAN Xiao-feng1， QIAN Ai-dong1

(1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China； 2.Shandong Baolai to Biological Engineering Co., Ltd，Taian 271000，China)

To investigate the effects of the feed of Lactobacillus casei on non-specific immunity and disease resistance in carp，three different concentrations of Lactobacillus casei (1×107CFU/g,1×108CFU/g,1×109CFU/g) were added to the basal diet for 6 weeks, and the initial culture weight of carp was 28±0.3g.The results showed that the contents of SOD and IgM increased significantly (P <0.05) at 1 × 108CFU / g, but the contents of SOD and IgM were inhibited at 1 × 109CFU /g.The LZM and POD activities (1 × 108CFU / g) were the highest at 28d, and 1 × 107CFU / g and 1 × 109CFU / g was lower than 1 × 108CFU / g, all the experimental groups were higher than the control group. While the activity of AKP in all experimental groups increased with the concentration of Lactobacillus casei. On the 42 day after feeding, the fishes were challenged with Aeromonas hydrophila strain TH0426, there were significant differences in the cumulative mortality after 14 days (P <0.05).Compared with the control group, the immune protection rate of Lactobacillus with 1 ×108CFU/g was 60%, followed by 1 × 107CFU/g, 1 ×109CFU/g. Thus, adding 1 × 108CFU / g of Lactobacillus casei to the basal diet could improve the non-specific immunity of carp and have higher immune protection effect.

Lactobacillus casei ; Carp ; Enzyme activity ; Immune effect

s: QIAN Ai-dong ; SHAN Xiao-feng

2016-12-09

國家自然科學基金項目(31201927)；吉林省重點科技攻關項目(20150204065NY)

張海朋(1989-)，男，碩士生，從事動物分子免疫學研究，E-mail：zhanghaipeng211@163.com

錢愛東，E-mail：qianaidong0115@163.com; 單曉楓，E-mail：sxf1997@163.com

TS2

A

0529-6005(2017)07-0085-04