反復凍融對血清樣品中三型口蹄疫免疫抗體效價的影響

趙明娟

(北京市懷柔區動物疫病預防控制中心 ， 北京懷柔101400)

反復凍融對血清樣品中三型口蹄疫免疫抗體效價的影響

趙明娟

(北京市懷柔區動物疫病預防控制中心 ， 北京懷柔101400)

為了研究反復凍融對血清樣品中免疫抗體效價的影響，隨機采集50份采用口蹄疫O型、A型、亞洲1型三價滅活疫苗進行過多次口蹄疫免疫的健康奶牛血清樣品，采用液相阻斷酶聯免疫吸附試驗分別檢測其中口蹄疫O型、A型、亞洲1型免疫抗體的效價。每份樣品檢測4次，檢測時間分別為采樣后、反復凍融1次后、反復凍融2次后、反復凍融3次后。冷凍條件為-20℃冷凍24 h，融解溫度為25 ℃。統計分析樣品4次檢測的口蹄疫O型、A型、亞洲1型免疫抗體效價變化，采用單因素方差分析進行差異顯著性分析。結果顯示，采樣后、反復凍融1次、反復凍融2次、反復凍融3次所測得的口蹄疫O型、A型、亞洲1型免疫抗體效價差異均不顯著，表明反復凍融3次以內不會影響血清樣品中免疫抗體效價。

反復凍融 ； 血清樣品 ； 免疫抗體效價

畜禽免疫抗體監測是畜禽重大動物疫病防控工作的重要環節，通過免疫抗體監測，不僅可以直接有效地反映畜禽體內免疫抗體水平，評估疫苗免疫質量和效價，制定科學的免疫程序[1]，同時也為動物疫病風險評估提供可靠依據，根據監測結果及時對不合格場戶進行補免，預防群體發病，降低疫情發生風險，保障養殖戶經濟效益[2]。

作為實驗室檢驗人員，正確地保存和處理送檢樣品、嚴格地試驗操作都是確保試驗結果準確性的必要條件[3]。根據《2015年國家動物疫病監測與流行病學調查計劃》，每種送檢動物血清樣品的抗體檢測項目也包括3種以上，例如豬血清樣品需檢測的免疫抗體項目包括豬瘟、高致病性豬藍耳病、口蹄疫O型等，奶牛血清樣品需檢測口蹄疫O型、亞洲1型、A型等，雞血清樣品需檢測高致病性禽流感H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株、新城疫等。在基層實驗室，由于人力和設備的不足，很難一次完成所有項目的檢測工作，待檢血清樣品反復凍融在所難免。

本試驗通過研究反復凍融3次的奶牛血清樣品中口蹄疫O型、亞洲1型、A型免疫抗體效價的變化，進一步揭示反復凍融血清樣品對其中抗體效價會產生何種影響，以期為廣大實驗室工作人員合理安排免疫抗體檢測試驗提供參考，確保試驗結果的準確性及有效性。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗樣品隨機采集50份采用口蹄疫O型、A型、亞洲1型三價滅活疫苗進行過多次口蹄疫免疫的健康奶牛血清樣品，所使用的口蹄疫三價滅活疫苗由金宇寶靈生物藥品有限公司生產。

1.2 試驗設計，試驗樣品采集后，未經冷凍，第1次檢測其中三型口蹄疫的免疫抗體效價，記錄結果；血清樣品經-20 ℃ 第1次冷凍24 h后，于25 ℃充分融解，第2次檢測其中三型口蹄疫的免疫抗體效價，記錄結果；血清樣品經-20 ℃第 2次冷凍24 h后，于25 ℃充分融解，第3次檢測其中三型口蹄疫的免疫抗體效價，記錄結果；血清樣品經-20 ℃ 第3次冷凍24 h后，于25 ℃充分融解，第4次檢測其中三型口蹄疫的免疫抗體效價，記錄結果。

1.3 試驗試劑口蹄疫A型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒，中國農業科學院蘭州獸醫研究所生產，批號20151027103-1，抗原批號15081003，抗原使用濃度1∶6；口蹄疫亞洲1型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒，中國農業科學院蘭州獸醫研究所生產，批號20150901102-1，抗原批號14122402，抗原使用濃度1∶6；口蹄疫O型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒，中國農業科學院蘭州獸醫研究所生產，批號20151016101-7，抗原批號15080401，抗原使用濃度1∶15。

1.4 試驗儀器與設備30～300 μL 12道移液器，5～50 μL 12道移液器，5～50 μL 單道移液器，1～10 mL 單道移液器，生產廠家均為Thermo。電熱恒溫培養箱，生產廠家Boxun，型號BPX-162。純水儀，生產廠家HITECH，型號Master-S。自動洗板機，生產廠家BioTek，型號405LSRS。酶標儀，生產廠家Thermo，型號MULTISKAN MK3。

1.5 試驗方法，血清樣品三型口蹄疫免疫抗體檢測均采用液相阻斷ELISA方法開展，試驗嚴格按照GB/T18935-2003口蹄疫診斷技術和試劑盒說明書進行操作。

1.6 試驗結果統計分析，對4組試驗數據采用單因素方差分析的方法進行統計學分析，研究其差異顯著性。

2 試驗結果，見表1。

表1 三型口蹄疫免疫抗體監測結果及分析統計

2.1 三型口蹄疫免疫抗體檢測結果分析 通過觀察與實驗原始數據，每份樣品4次檢測的三型口蹄疫免疫抗體效價基本一致，偶爾有個別效價出現偏差，并未呈現規律性下降，分析原因可能是由于試驗誤差所致。

50份樣品4次檢測的三型口蹄疫免疫抗體效價平均值變化不大，相差在一個滴度內。

2.2 三型口蹄疫免疫抗體檢測結果差異顯著性分析 采用單因素方差分析對實驗數據進行統計學分析，結果顯示，三型口蹄疫免疫抗體檢測結果P值均大于0.05，差異不顯著，表明反復凍融3次以內不會造成待檢血清樣品中的三型口蹄疫免疫抗體效價產生變化。

3 討論

3.1 鐘錦輝(2013)通過實驗證明，多次凍融不會造成血清豬瘟抗體效價的顯著降低[4]。本試驗結果表明，反復凍融3次以內不會對血清樣品中的口蹄疫O型、亞洲1型、A型免疫抗體效價造成影響。在實驗室人員和設備不足的情況下，將送檢樣品適當凍融不會造成檢測結果的偏差，仍然具有可信度。值得注意的是，融解血清樣品的溫度不宜太高，本試驗選擇的是25 ℃，屬于一般試驗反應的正常溫度，若融解溫度高于37 ℃，可能引起樣品變質，造成抗體效價降低。

3.2 疫苗免疫屬于人工主動免疫，在畜禽體內產生的抗體主要成分為免疫球蛋白IgG。IgG在動物體內含量高、持續時間長，具有抗菌、中和病毒和毒素等免疫學活性，是畜禽機體內抗感染免疫的主力，也是血清學診斷和疫苗免疫后監測的主要抗體。由于免疫球蛋白屬于大分子蛋白質，引起待檢血清中免疫抗體效價降低的原因，可能是抗體在某些物理或化學因素作用下，其特定的空間結構被破壞，導致理化性質改變和生物學活性的喪失，即蛋白質發生變質。引起蛋白質變性的原因包括物理因素和化學因素兩類。物理因素有加熱、振蕩、紫外線照射、超聲波作用等；化學因素有強酸、強堿、重金屬鹽等。冷凍屬于低溫因素，并不是引起蛋白質變性的主要因素。有研究顯示，血清樣品，在2 ℃～8 ℃的冰箱中，可保存15 d，-15 ℃以下冷凍可保存2年[5]，因此，少次的反復凍融并不會對待檢血清樣品中的免疫抗體效價產生影響。

3.3 根據北京市動物疫病預防控制中心發布的《關于做好2016年動物防疫工作的通知》(京疫控〔2016〕16號)2016年北京市強制免疫動物疫病種類有7種，包括高致病性禽流感、口蹄疫、高致病性豬藍耳病、豬瘟、狂犬病、小反芻獸疫和羊布魯菌病；根據《2016年北京市動物疫病監測計劃實施方案》(京疫控〔2016〕15號)2016年動物疫病監測種類包括免疫抗體檢測和病原學監測兩大類。根據文件要求，每份待檢血清樣品檢測項目都在5項左右，不需要反復凍融多次。本試驗從實際出發，本著應用性強的原則，只研究了反復凍融3次以內血清樣品中口蹄疫O型、亞洲1型、A型免疫抗體效價的變化情況，結果顯示不受影響，但并不表明多次反復凍融不會導致血清樣品中抗體效價降低，具體影響如何還有待進一步研究。

3.4 本試驗只研究了反復凍融3次以內對待檢血清樣品中口蹄疫O型、亞洲1型、A型免疫抗體效價不會產生影響，在工作實踐中，一份待檢血清樣品需要檢測多種抗體效價的情況還包括豬、羊、犬、雞、鴨、鵝等畜禽的血清樣品。由于抗體的成分都是免疫球蛋白，其生物學特性基本相似，推斷此試驗的結論也應該適用于其他抗體檢測試驗，實際如何有待進一步驗證。

[1] 劉永波，宋春蓮，謝相悅，等.云南4 個規模化豬場豬瘟抗體水平監測及免疫效果分析[J].中獸醫學雜志，2017，1: 84-86.

[2] 馬 琪，韓冬林. 畜禽免疫抗體監測工作存在的問題及對策[J]. 養殖技術顧問，2011，12: 195.

[3] 田肖，紀高華，任友安. 影響動物免疫抗體檢測結果的因素分析[J]. 湖北畜牧獸醫，2017，38(1): 39-40.

[4] 鐘錦輝，張海明，段曉冬，等. 血清凍融次數對豬瘟抗體效價的影響[J]. 廣東畜牧獸醫科技 ，2013，38(1): 17-19.

[5] 羅承金. 畜禽免疫抗體監測血樣采集與血清分離保存技術[J]. 山東畜牧獸醫 ，2012，33(2): 48-49.

2016-12-31

趙明娟(1981-)，女，高級獸醫師，碩士，從事動物疫病監測和檢測研究，E-mail: zmj168_ren@163.com

S852.5

B

0529-6005(2017)07-0095-02