天津株(TJM-F92)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗免疫后病毒血癥和抗體消長規律的試驗報告

楊本勇 ， 曹 東 ， 顧貴波 ， 趙曉彤 ， 趙鳳菊 ， 于學武 ， 關 淼 ，李樹博 ， 王克才 ， 李井春 ， 魏 澍

(遼寧省動物疫病預防控制中心遼寧省動物醫學研究院 ， 遼寧沈陽110164)

天津株(TJM-F92)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗免疫后病毒血癥和抗體消長規律的試驗報告

楊本勇 ， 曹 東 ， 顧貴波 ， 趙曉彤 ， 趙鳳菊 ， 于學武 ， 關 淼 ，李樹博 ， 王克才 ， 李井春 ， 魏 澍

(遼寧省動物疫病預防控制中心遼寧省動物醫學研究院 ， 遼寧沈陽110164)

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(HP-PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株引起的一種急性高致死性疫病。發病主要特征為懷孕母豬流產、早產、木乃伊胎等，母豬流產率可達30%以上；仔豬出現嚴重的呼吸道癥狀，感染率可達100%，死亡率在50%以上[2-3]。目前我國使用的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗均為活疫苗，據報道活疫苗免疫后可在動物體內復制并持續存在。為摸清高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗免疫后在豬體內的存在時間，我們進行了本試驗，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗豬 在某豬場選擇28～30日齡、未進行高致病性豬繁殖與呼吸綜合征免疫的長白仔豬15頭，經熒光RT-PCR檢測，豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、2型圓環病毒、豬偽狂犬病病毒均為陰性，實驗豬編號為A1-A15。

1.1.2 疫苗 天津株(TJM-F92株)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗，政府招標采購。

1.1.3 RT-PCR試劑 鑒別檢測豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)高致病性強毒和致弱TJM-F92株疫苗毒的RT-PCR引物，由華威特生物科技有限公司提供，擴增片段位于NSP2基因；dNTP、M-MLV反轉錄酶、RNA酶抑制劑、ExTaq聚合酶等，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.4 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測試劑盒 購自北京天之泰生物科技有限公司，法國LSI公司生產。

1.1.5 核酸提取試劑 核酸提取試劑盒(磁珠法)，購自西安天隆生物科技有限公司。

1.1.6 試驗器材 eppendorf微量移液器，PCR儀，電泳儀，凝膠成像系統，西安天隆生物科技有限公司NP968核酸提取儀，伯樂iMark酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 免疫注射 按疫苗說明書提供的免疫劑量和注射部位對試驗豬進行免疫注射。

1.2.2 采血 試驗豬在免疫前采血1次；免疫后每隔1周采血1次，連續采10周；以后每隔2周采血1次，連續采4次。無菌分離血清，進行高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗毒(TJM-F92株)核酸檢測和抗體檢測。

1.2.3 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(TJM-F92株)核酸檢測 用RT-PCR方法進行檢測。

1.2.3.1 核酸提取 在96孔核酸提取板的第1列孔及第7列孔中分別加入200 μL血清，10 μL Proteinase K，4 μL Acryl Carrier，然后將板放入核酸提取儀中，按說明書程序進行自動化提取。

1.2.3.2 反轉錄 樣品RNA 5 μL，反轉錄引物 1 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，5×Buffer 4 μL，M-MLV 1 μL，RNA酶抑制劑1 μL，DEPC水5 μL。混勻，42 ℃水浴1小時，70 ℃水浴15分鐘后冰上冷卻，得到cDNA溶液用于PCR擴增。

1.2.3.3 PCR擴增 cDNA 2 μL，10×Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ExTaq聚合酶0.5 μL，雙蒸水13 μL。混勻后將薄壁PCR管放入PCR儀中，按如下程序擴增：首先95 ℃預變性5 min；然后94 ℃ 30 s,56 ℃ 60 s,72 ℃ 45 s,35個循環。最后72 ℃延伸10 min。反應結束后，將PCR產物用濃度為1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓 100 V,電泳20 min。電泳結束后用凝膠成像系統觀察。若擴增出約644 bp的特異性條帶，則高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗毒(TJM-F92株)核酸陽性。

1.2.4 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測 按試劑盒說明書的步驟和要求操作。阻斷率(IRPC)大于20%為抗體陽性，阻斷率越大，抗體水平越高。

2 結果與分析

2.1 TJM-F92株疫苗核酸檢測結果(表1)由表1可知，免疫前疫苗毒核酸均為陰性。在免疫后1周時有4頭豬疫苗毒核酸為陽性，陽性率27%(4/15)，免疫后2周時陽性率13%(2/15)，在免疫后第3周時陽性率最高，為47%(7/15)，此后開始下降，至第6周時只有7%(1/15)。從第7周開始再沒有檢出陽性，表明，TJM-F92株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗毒的病毒血癥時間最長為6周。

表1 血清中TJM-F92株疫苗毒核酸檢測結果

2.2 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測結果 見表2。從表2可以看出，由于母源抗體的存在，免疫前抗體陽性率達到87%，免疫后抗體陽性率開始下降，至免疫后第2周時下降至33%，隨后開始緩慢上升，至免疫后第3周時上至47%，第4周時升至53%，到免疫后第5周時突然上升至100%，并一致持續到第12周，隨后開始稍有下降。抗體平均阻斷率在免疫前也處在較高水平，達到72%，免疫后開始下降，至免疫后第2周時降至最低，只有18%，為陰性。此后開始慢慢上升，至免疫后第6周時達到最高值78%，此后開始緩慢下降。

3 討論

3.1 從實驗豬血清中TJM-F92株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗毒存在時間的變化規律可以看出，不同豬只病毒血癥的持續時間差異較大，有的沒有出現病毒血癥，有的只存在1周，最長的可以達到免疫后第6周。因此TJM-F92株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗免疫后病毒血癥持續時間為6周。

3.2 本試驗的抗體檢測結果表明，疫苗免疫后，豬體內的母源抗體會明顯下降，降到合格臨界值附近，這一低水平的抗體一直持續至免疫后第4周，從第5周開始疫苗免疫產生的抗體水平明顯上升，至第6周時達到最高水平，并維持在一個平臺到免疫后第16周，本試驗的結果表明，無論仔豬的母源抗體水平高低，免疫后大約都需要經過4周左右的時間才能產生較高的抗體水平。因此免疫后的第1周至第4周抗體水平比較低，是比較危險的時期[4]。

表2 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測結果

3.3 比較實驗豬的病毒血癥陽性率與平均抗體水平的變化規律(見圖1)可以發現，病毒血癥的嚴重程度與抗體水平的高低呈負相關，即抗體水平低時，病毒血癥就比較嚴重，隨著抗體水平的不斷上升，病毒血癥逐漸減弱，當抗體維持在較高水平時，病毒血癥消失[1]。這種現象的出現，可能是動物體內疫苗毒同抗體之間“互相斗爭”的結果，疫苗免疫后刺激動物機體產生抗體，產生的抗體又不斷的將活疫苗毒中和。而隨著免疫時間的延長，抗體水平進一步提高，疫苗毒不斷的被中和，以致無法被檢測到[3]。

圖1 病毒血癥陽性率與平均抗體水平變化曲線

[1] 黃名英,傅安靜,劉平，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染早期體內增殖規律調查[J].畜牧與獸醫,2013,45(2):50-54.

[2] 李明義,白志娟,王莉娟，等.豬瘟滅活疫苗抗體消長規律動態研究[J].中國預防獸醫學報,2005,27(5):385-388.DOI:10.3969/j.issn.1008-0589.2005.05.017.

[3] 魏園園，顧貴波，申冠男，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗(JXA1-R株)免疫后病毒血癥和抗體消長規律[J].中國獸醫雜志，2016,52(4):44-45.

2016-04-13

遼寧省重大動物疫病病原變異與綜合防控技術研究(2011214001)；高致病性豬藍耳病綜合防控與免疫凈化技術推廣[遼財指農(2013)1334號]

楊本勇(1973- )，男，高級獸醫師，本科，從事動物疫病防控工作,E-mail：benyong@tom.com

顧貴波，E-mail：guguibo8888@126.com

S852.65+9

B

0529-6005(2017)07-0056-02