火雞禽霍亂的病原鑒定及病理學觀察

么乃全 ， 邸海洋 ， 李新殿 ， 張 敏 ， 李斯齊 ， 高云航 ， 徐鳳宇

(1.吉林農業大學動物科技學院 ， 吉林長春130118 ； 2.長春動植物公園 ， 吉林長春130400 ；3.吉林農業大學中藥材學院 ， 吉林長春130118 ； 4.中國獸醫藥品監察所 , 北京海淀100081)

火雞禽霍亂的病原鑒定及病理學觀察

么乃全1， 邸海洋2， 李新殿3， 張 敏4， 李斯齊1， 高云航1， 徐鳳宇1

(1.吉林農業大學動物科技學院 ， 吉林長春130118 ； 2.長春動植物公園 ， 吉林長春130400 ；3.吉林農業大學中藥材學院 ， 吉林長春130118 ； 4.中國獸醫藥品監察所 , 北京海淀100081)

對長春某觀賞動物園區疑似急性禽霍亂的火雞病例進行實驗室診斷，病原經染色鑒定為革蘭陰性兩極濃染的球桿菌，進一步16S rRNA序列測定與分析顯示，該病原為多殺性巴氏桿菌。病理組織學觀察可見火雞肝臟淤血、細胞壞死；小腸呈卡他性出血性腸炎；肺臟充血、間質增寬，符合禽霍亂病理組織學特點。藥敏試驗顯示，該菌對阿米卡星、米諾環素、頭孢哌酮、慶大霉素敏感，采用敏感抗生素注射結合嚴格消毒措施控制了該病的發生和蔓延。

火雞 ； 多殺性巴氏桿菌 ； 鑒定 ； 病理學

禽霍亂是由多殺性巴氏桿菌引起禽類的一種敗血性、致死性傳染病，能感染所有禽類且多為致死性感染。該病仍是危害我國養禽業的主要細菌性疫病之一，發病率為10%～70%，病死率30%～80%[1]。健康攜帶病原或感染的禽類均是重要的傳染源[2]。成年火雞的易感性最高，發病最為嚴重，國內禽霍亂病例主要見于雞、鴨和鵝，關于火雞發生禽霍亂的報道較少[3]。

2014年8月長春市某觀賞動物園區內5只火雞相繼發生急性死亡，其中2只于夜間死亡，3只清晨見有精神委靡、不食、羽毛蓬亂的表現，于中午前后相繼死亡。為了確診該病，對死亡火雞進行病理剖檢、病原分離鑒定及病理組織學觀察，確定引起此次疫情的病原為多殺性巴氏桿菌。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 犢牛血清，購自浙江天杭生物技術有限公司；TSA、TSB培養基，均為北京奧博星生物技術責任有限公司產品；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；PCR反應預混液、DNA Marker、DNA純化回收試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司；革蘭氏、美藍染色液均為實驗室自行配制保存；蘇木素-伊紅染色試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司；其他化學試劑均為國產分析純試劑。

1.2 菌株 多殺性巴氏桿菌C48-11(Pasteurellamultocida，CVCC 462)，購自中國獸醫藥品監察所。待鑒定的疑似火雞多殺性巴氏桿菌命名為PmccTk-1。

1.3 藥敏紙片 慶大霉素、卡那霉素、米諾環素、多西環素、新霉素、紅霉素、頭孢氨芐、頭孢拉啶、哌拉西啉、羧芐西啉、苯唑西啉、阿米卡星、氨芐西林、頭孢哌酮、頭孢曲松、四環素、青霉素、頭孢唑啉、頭孢他啶、阿奇霉素、多粘菌素B的藥敏紙片，均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4 病雞剖檢 按照常規剖檢術式進行，心血及肝臟組織觸片制作均在超凈工作臺中進行，革蘭染色、美藍染色參照《獸醫微生物實驗診斷手冊》方法進行[4]。

1.5 病原分離培養 無菌采集病死雞的心血、肝臟，劃線接種于含10%犢牛血清的TSA平板培養基，于37 ℃恒溫培養箱中培養，12 h后觀察結果。

1.6 藥敏試驗 經10%血清TSB培養基增菌培養后的菌液，均勻涂布于TSA平板培養基，37 ℃恒溫培養箱中孵育1 h，用無菌鑷子將藥敏紙片貼于培養基表面，24 h后測量抑菌圈直徑。

1.7 16S rRNA基因序列分析 參照試劑盒方法提取細菌基因組DNA，16S rRNA通用引物(27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進行目的基因的PCR擴增。方法參照文獻[5]，預期片段大小約為1 500 bp，測序后與GenBank中公布的基因序列進行比對分析。

1.8 病理組織學檢查 采集病死火雞心、肝、肺和腸等組織經10%福爾馬林固定，常規石蠟制片、H.E.染色，供病理組織學檢查。

2 結果

2.1 病理剖檢結果 死亡火雞的剖檢病理特征十分相似，胸腔壁和腹膜可見大量出血斑點；心包淡黃色積液，心外膜及心冠脂肪有出血斑點(見封二彩版圖1)；肝臟腫大，表面有大量灰白色壞死斑點(見封二彩版圖2)；肺部充血、水腫(見封二彩版圖3)；腺胃乳頭間大量出血點(見封二彩版圖4)；十二指腸高度充血、出血、水腫，腸腔內大量膠胨樣凝血塊(見封二彩版圖5)；氣管中積有多量黏液，黏膜散在出血點；睪丸充血、腫大(見封二彩版圖6)。

2.2 病料涂片染色鑒定結果 病死火雞心血、肝臟涂片經革蘭染色鏡檢可見紅色球桿菌(見封二彩版圖7)，美藍染色鏡檢可見兩端著色短小桿菌(見封二彩版圖8)，符合巴氏桿菌的染色特征。

2.3 病原分離鑒定結果 在TSA培養基上可見面光滑、透明的、露滴狀小菌落，革蘭、美藍染色鏡檢結果與病料染色結果一致。

2.4 16S rRNA序列測定及分析 擴增的16S rRNA基因序列與GenBank中已公布基因序列進行Blast比對，MegAlign軟件分析結果如圖13所示，與C48-11等幾種禽源多殺性巴氏桿菌的同源性均在98%以上，參照相關文獻的報道[6]，可以確定該菌株為多殺性巴氏桿菌。

圖13 火雞巴氏桿菌16S rRNA序列同源性分析

1:PmccTk-1; 2:CVCC C48-11; 3:HPs-1; 5:NCTC 10204; 6:HIM830-7T; 7:PM106; 8:HaiNGoosePm2012

2.5 病理組織學觀察結果 肝臟靜脈淤血、擴張，管腔與竇內充有大量紅細胞，部分肝細胞壞死，胞核溶解、空泡化(見封二彩版圖9)；心肌纖維斷裂、崩解，部分胞核消失，間質中存在紅細胞和白細胞浸潤(見封二彩版圖10)；小腸黏膜固有層明顯充血、出血，白細胞浸潤，腸黏膜上皮細胞壞死脫落，呈卡他性出血性腸炎(見封二彩版圖11)；肺臟中小靜脈擴張充血，間隔增寬，可見多量白細胞浸潤(見封二彩版圖12)。

2.6 藥敏試驗結果 結果顯示，該菌株對卡那霉素、多西環素、新霉素、紅霉素、頭孢氨芐、頭孢拉啶、哌拉西啉、羧芐西啉、苯唑西啉、氨芐西林、頭孢曲松、四環素、青霉素、頭孢唑啉、頭孢他啶、阿奇霉素、多黏菌素B表現出不同程度的耐藥性；而對阿米卡星、米諾環素、頭孢哌酮、慶大霉素較為敏感。

3 討論

此次火雞發生禽霍亂的病程短、病死率高，瀕死前的臨床特征不明顯，剖檢病理變化卻較典型，符合禽霍亂病變特點。病原經實驗室分離鑒定和16S rRNA序列鑒定進一步證實為多殺性巴氏桿菌。病理組織學觀察可見火雞肝臟淤血、細胞壞死；心肌纖維斷裂，白細胞浸潤；小腸黏膜固有層充血、出血，呈卡他性出血性腸炎；肺臟充血、間質增寬。符合禽霍亂的病理組織學特點。

該園區火雞在發生禽霍亂前一直于舍內飼養，轉到室外的飼養區周圍為其他觀賞禽類，推測此次禽霍亂的暴發很可能是由其他觀賞禽類傳播所致。火雞在飼養過程中未曾進行過疫苗免疫，也未投喂過各種抗菌藥物，從而導致急性感染的發生。通過敏感抗生素注射結合嚴格的消毒措施，此次疫情得到了控制。

火雞對多殺性巴氏桿菌的易感性極高，發病多為最急性感染，具有很高的致死率，因此在火雞養殖中應十分注意禽霍亂的防控。若有條件可用地區流行的血清型多價滅活疫苗或自家滅活疫苗進行免疫預防，同時應注意不能與家禽混養，防止家禽攜帶病原發生傳播，動物觀賞園區注意火雞不與其他觀賞禽類混養。

[1] 施少華, 程龍飛, 傅光華，等. 檢測禽多殺性巴氏桿菌PCR方法的建立[J]. 福建農業學報, 2009, 24(3): 201-204.

[2] Christensen J P, Bisgaard M. Fowl cholera[J].RevSciTech, 2000, 19(2): 626-637.

[3] 廖素環, 韋天超, 騫慧，等. 一起火雞禽霍亂的診治[J]. 養禽與禽病防治, 2011, 8:36-37.

[4] 么乃全, 王全凱, 姜秀云，等. 鴨疫里氏桿菌外膜微孔蛋白基因的克隆和序列分析及PCR檢測方法的建立[J]. 中國獸醫科學, 2013, 43(07):723-727.

[5] 廖延雄. 獸醫微生物實驗診斷手冊[M]. 北京: 中國農業出版社, 1995:59-61.

[6] Fry N K, Warwick S, Saunders N A,etal. The use 16S ribosomal RNA analyses to investigate phylogeny of the familyLegionellaceae[J].JGenMicr-obiol, 1991, 137(5):1 215-1 222.

Pathogen Identification and Pathological Observation of Turkey Fowl Cholera

YAO Nai-quan1, DI Hai-yang2, LI Xin-dian3, ZHANG Min4, LI Si-qi1, GAO Yun-hang1, XU Feng-yu1

(1.College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2.Changchun Animal and plant park, Changchun 130061, China; 3.College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 4. China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081，China)

Laboratory diagnosis was carried out for turkeys of an ornamental zoo in Changchun suspected acute fowl cholera by clinical diagnosis. The microscopic examination of isolated pathogen showed that it was a kind of small Gram negative bacilli with bipolar staining characteristics. 16S rRNA sequence analysis indicated the strain wasPasteurellamultocida. Histopathological observation consist with characteristics of fowl cholera with liver congestion and cell necrosis, catarrhal hemorrhagic enteritis, lung congestion and interstitial width increased. Susceptibility test showed the strain was sensitive to amikacin, minocycline, cefoperazone, gentamicin. Disease outbreak was controlled by sensitive antibiotic injection combined with strict disinfection measures.

Turkey ;Pasteurellamultocida; Identification ; Pathology

XU Feng-yu

2016-03-04

吉林農業大學博士啟動基金項目(201405)；吉林省教育廳“十三五”科學技術研究項目(2016192)

么乃全(1980-)，男，講師，博士生，從事動物傳染病診斷及免疫研究，E-mail:ynq1980@163.com

徐鳳宇，E-mail: xvfengyv2002@126.com

S832

A

0529-6005(2017)07-0045-02