玉屏風多糖體外抗新城疫病毒效果的研究

戴超月 ， 蔣焱平 ， 郭 彥 ， 劉雨桐 ， 楊 鴻 ， 計慧琴 ， 鄧 樺

(佛山科學技術學院動物醫學系, 廣東佛山528231)

玉屏風多糖體外抗新城疫病毒效果的研究

戴超月 ， 蔣焱平 ， 郭 彥 ， 劉雨桐 ， 楊 鴻 ， 計慧琴 ， 鄧 樺

(佛山科學技術學院動物醫學系, 廣東佛山528231)

以新城疫病毒(NDV)感染雞胚和雞胚成纖維細胞，探索玉屏風多糖(Yupingfeng polysaccharides YPF-P)及其含藥血清的抗病毒效果。SPF兔采用500 mg/kg體重YPF-P灌服給藥，于第1、3、5、7天采集全血，制備不同濃度含藥血清；培養SPF雞成纖維細胞(CEF)，分別加入不同濃度的YPF-P及其含藥血清，進行細胞毒性試驗；采用先加多糖后加病毒、先加病毒后加多糖、多糖和病毒感作后同時加入的3種給藥方式，觀察YPF-P及其含藥血清對病毒的阻斷、抑制和直接殺滅作用。結果與正常對照組相比，不同濃度YPF-P(0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL)和7 d的YPF-P含藥血清的CEF細胞活性均顯著增強(P<0.05或P<0.01)。CEF培養24 h后，YPF-P抑制病毒作用明顯，與NDV對照組相比差異極顯著(P<0.01)；3種給藥方式與NDV對照組相比，含藥血清組細胞活性均極顯著升高(P<0.01)。表明YPF-P及其含藥血清均對CEF無毒副作用，且可顯著增強細胞活性；YPF-P及其含藥血清有較好的抑制病毒毒性的作用。

玉屏風多糖 ； 含藥血清 ； 細胞活力 ； 抗病毒

多糖類藥物具有治療功能全面，覆蓋面廣泛的優勢，所產生的毒害性作用小，有害殘留少[1]。據相關研究表明，YPF-P能促使人與動物胸腺、脾臟等免疫器官的生長發育，增強免疫細胞的活性，提高各種疫苗的接種效果以及延遲抗體的持續時間，可免疫調節功能，并促進機體免疫球蛋白的形成[2-3]。YPF-P還能有效提高佐劑性關節炎大鼠的T細胞亞群數，顯著促進小鼠腹腔的巨噬細胞吞噬功能、脾淋巴細胞增殖、相關遲發型超敏反應以及溶血素抗體生成等[4-5]。但是，目前YPF-P體外抗病毒的研究尚不多見。本文提純YPF-P，制備不同濃度的YPF-P及其含藥血清，以NDV感染雞胚和雞胚成纖維細胞探索YPF-P及其含藥血清的體外抗病毒效果，為中藥多糖含藥血清的臨床應用打下理論基礎。

1 材料與方法

1.1 制備YPF-P 將藥粉黃芪、防風和白術按質量比3∶1∶1配制成的玉屏風散，置于1 L的圓底燒瓶中，通過水提取，過濾加熱濃縮，醇提純，最后經過真空冷凍干燥機在低溫下制成粉末狀的精制YPF-P，分裝后4 ℃保存備用。

1.2 制備YPF-P含藥血清 12只SPF新西蘭兔隨機分2組，給藥組灌胃YPF-P 500 mg/kg體重·d;對照組灌服等體積的生理鹽水；1次/d，共7 d，最后1次給藥1 h 后心臟采血，37 ℃靜置1 h后放4 ℃冰箱過夜，5 000 r/min 離心5 min，取血清同組合并后，56 ℃ 滅活30 min，0.22 μm 濾過除菌，-20 ℃保存備用。

1.3 ND病毒的檢測

1.3.1 ND病毒復壯 9日齡的SPF雞胚15只，每只注射0.2 mL新城疫原胚液，37 ℃恒溫箱中孵育，間隔12 h檢查1次，收集24～72 h死亡雞胚的尿囊液，0.22 μm過濾，-80 ℃保存。

1.3.2 NDV半數致死量 準備11個10 mL EP管，在第1管中加入1 mL的已復壯的胚液，2～11管用移液槍各加入0.9 mL生理鹽水，用100 μL移液槍從第1管吸取出0.1 mL試液轉移到第2管(移液槍在第2管時反復吹打幾次，混合試液)，從第2管中吸取出0.1 mL到第3管，重復上述步驟直到第11管，最后除去0.1 mL試液。濃度分別為1∶1、1∶10～1∶1010。將SPF雞胚分成11組，每組6個，接種病毒液2 mL/只,72 h后，檢查并記錄雞胚死亡數量，計算NDV雞胚半數致死量。

1.4 測定項目和方法

1.4.1 CEF原代培養 9日齡的SPF胚蛋，通過取材、剪材、消化、制備CEF細胞懸液、加入10%胎牛血清，置于37 ℃、飽和濕度的5 %CO2培養箱內培養。

1.4.2 YPF-P及其含藥血清細胞活性檢驗 雞胚成纖維細胞傳代培養12 h后，按照表1、表2加入不同濃度的YPF-P及其含藥血清，除空白對照組仍然加入10%的胎牛血清外，為盡量減少胎牛血清對試驗結果的干擾，其余各試驗組均加入2%胎牛血清維持細胞生長。采用MTT法檢測，在全自動酶標儀上比色(波長490 nm)。以觀察YPF-P及其含藥血清對CEF的影響，并篩選出最佳作用劑量。

表1 YPF-P細胞活性檢驗的給藥劑量及分組 (n=16, mg/mL)

表2 YPF-P含藥血清細胞活性檢驗的給藥劑量及分組 (n=16, mg/mL)

1.4.3 YPF-P及其含藥血清體外抗NDV研究 根據1.4.2結果，選擇YPF-P及其含藥血清的最佳作用劑量，以3種不同加藥方式研究其抗病毒效果，具體分組見表3。

表3 YPF-P及其含藥血清體外抗NDV的試驗分組 (n=16)

2 結果

2.1 ND病毒的檢測結果 11組雞胚，在72 h內均有不同程度的死亡。其中將病毒1∶107倍稀釋時，接種雞胚(0.2 mL/個)首先可使50%雞胚死亡，因此確定NDV半數致死濃度為1∶107。

2.2 YPF-P及其含藥血清對CEF活性的影響

2.2.1 YPF-P對CEF活性的影響 YPF-P提純率為88.9%。不同濃度的YPF-P(0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL)之間無顯著差異(P>0.05)，與正常對照組相比差異極顯著(P<0.01)，雞胚成纖維細胞活性顯著增強。見圖1。

圖1 不同YPF-P劑量對CEF活性的影響注：大寫字母不同者表示P<0.01

2.2.2 YPF-P含藥血清對CEF活性的影響 結果可見，不同劑量的含藥血清組之間，細胞活性差異極顯著(P<0.01)，但第7 天含藥血清組與胎牛血清組之間無差異(P>0.05)。見圖2。

圖2 不同天數含藥血清對CEF活性的影響注：大寫字母不同者表示P<0.01

2.3 YPF-P及其含藥血清體外抗NDV研究

2.3.1 YPF-P體外抗NDV結果 由圖3可見，陽性YPF-P對照組細胞活性最高，陰性ND病毒對照組、殺滅作用組和阻斷作用組細胞活性最低。經方差分析，正常胎牛血清對照組細胞活性與殺滅作用組、阻斷作用組和陰性對照組差異極顯著(P<0.01)。3種加樣方式之間差異極顯著(P<0.01)，且抑制作用組細胞活性顯著高于殺滅作用組、阻斷作用組。陰性對照組與殺滅作用組、阻斷作用組之間無顯著差異(P>0.05)，說明多糖對病毒沒有殺滅和阻斷作用。陽性YPF-P對照組與其他各組之間差異極顯著(P<0.01)，細胞活性最高，且顯著高于正常對照組。

圖3 YPF-P體外抗NDV對細胞活力的影響注：大寫字母不同者表示P<0.01

2.3.2 YPF-P含藥血清體外抗NDV結果 由圖4可見，陽性YPF-P含藥血清組細胞活性最高，與正常對照組差異顯著(P<0.01或P<0.05)，與其他各組差異極顯著(P<0.01)。陰性對照組、殺滅作用組、阻斷作用組的細胞活性最低。正常胎牛血清組細胞活性與殺滅、抑制、阻斷、陰性組相比，差異極顯著(P<0.01)，陰性對照組與殺滅作用組、阻斷作用組之間無顯著差異(P>0.05)，說明YPF-P含藥血清對病毒沒有殺滅和阻斷作用。3種加樣方式之間抑制作用組細胞活性顯著高于殺滅、阻斷作用組，差異極顯著(P<0.01)。

圖4 YPF-P含藥血清體外抗NDV對細胞活力的影響注：圖中小寫字母不同者表示P<0.05; 大寫字母不同者表示P<0.01

3 討論

3.1 YPF-P及其含藥血清的細胞活性試驗 從圖1中可知，不同濃度的YPF-P試驗組的細胞活性均比胎牛血清對照組的細胞活性高，各試驗組之間的細胞活性差異不顯著，隨著YPF-P濃度增加，細胞活性并沒有規律性升高或降低，表明YPF-P雖然對細胞活性有顯著提高作用，但是并不隨多糖濃度劑量的變化而提高或降低。

從圖2中可知，不同劑量的含藥血清組之間，細胞活性隨著濃度的增加而升高，第7 天的含藥血清組的細胞活性與胎牛血清組之間無顯著差異，說明高濃度含藥血清對CEF無明顯毒副作用。

3.2 YPF-P及其含藥血清體外抗NDV效果 在YPF-P試驗中，結果提示感染初期病毒毒力較強，YPF-P僅對病毒有一定抑制作用，無明顯的殺滅、阻斷作用。YPF-P可能與細胞膜表面的病毒吸附蛋白受體結合[6]，并且在一定程度上阻止病毒的吸附和進入。

CEF繼續培養24 h后，YPF-P對病毒有明顯的抑制作用，但是殺滅和阻斷作用不明顯。說明其抗病毒作用主要是通過與細胞膜表面的病毒吸附蛋白受體結合或改變病毒吸附蛋白受體來保護細胞而實現的，而并非直接殺滅病毒，而病毒一旦侵入并破壞細胞后，多糖亦不能提高細胞的抗感染能力。

在YPF-P含藥血清3種加樣方式試驗中，培養24 h后，發現YPF-P含藥血清對ND病毒也無明顯的殺滅和阻斷作用，確有極顯著的抑制作用。陽性對照組和正常對照組相比，YPF-P含藥血清對細胞生長有顯著的促進作用。

由本試驗結果可知，YPF-P及其含藥血清均對細胞無毒副作用，均可顯著增強細胞活性；YPF-P能夠阻斷NDV的吸附和進入，對雞胚成纖維細胞有較好的保護作用；YPF-P含藥血清不但可阻斷NDV對雞胚成纖維細胞的吸附和侵入，還可較好的抑制病毒的毒性。

[1] 張曉霜，王妙妙，辛萌，等.褐藻多糖抗病毒作用研究進展[J].中國海洋藥物,2016,35(2):87-94.

[2] 鄧樺，楊鴻，張兆，等.玉屏風復合多糖對環磷酰胺免疫抑制小鼠的恢復作用[J].中國獸醫學報，2014，34(2)：288-292.

[3] 鄧樺，楊鴻，仝錫瑤，等.玉屏風多糖對免疫抑制小鼠紅細胞免疫功能的影響[J].中國獸醫雜志，2016,52(2)：56-58.

[4] 陳瑩瑛. 玉屏風多糖對佐劑性關節炎大鼠T細胞亞群的影響[D]. 合肥：安徽醫科大學, 2009.

[5] 楊鴻，陳杖榴，鄧樺，等. 玉屏風多糖對免疫低下小鼠血清IL-2和IFN-γ含量的影響[J]. 安徽農業科學，2014，42(12)：3 571-3 572.[6] 楊鴻，陳杖榴，鄧樺，等.加味玉屏風散對雞紅細胞免疫和自由基的影響[J].中國獸醫科學，2006,36(01)：70-73.

[7] 陳向濤，李俊.玉屏風散的藥理學研究進展[J].安徽醫藥,2003,7(4):241.

[8] Jiang B, Zhang H, Liu C,etal. Extraction of water-soluble polysaccharide and the antioxidant activity from Ginkgo biloba leaves[J]. Medicinal Chemistry Research, 2010, 19(3):262-270.

[9] Li Q,Li C,Yang C,etal.Preparation,characterization and antioxidant activities of poly mannuronic acid phos-phate,H-phosphonate and sulfate[J].Int J BiolMacro-mol,2013,62:281-286.

Study the antiviral effect of Yupingfeng Polysaccharides on Vitro

DAI Chao-yue ， JIANG Yan-ping , GUO Yan ， LIU Yu-tong ，YANG Hong ， JI Hui-qin ， DENG Hua

(Department of Veterinary Medicine,Foshan University, Foshan 528231,China)

To explore the antiviral effect of YPF-P and drug-containing serum-on chicken embryo and CEF infected by NDV. SPF rabbits was drenched with YPF-P (500 mg/kg), the blood sample were collect at 1,3,5,7 days, and the different concentrations of medicated sera were prepared. To do cell toxicity experiments the SPF chicken fibroblasts were cultivated with different concentrations of YPF-P and drug-containing serum. For three ways to medicine the virus was first added，the virus was added before adding polysaccharide or the mixed of polysaccharide and virus was added. Then we observed the effect of YPF-P and drug-containing serum on blocking, killing and restraining virus effect.Compared with normal control group, different concentrations of YPF-P (0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 mg/mL) and YPF-P drug-containing serum (7 d) of CEF activity were enhanced significantly(P<0.05 orP<0.01).After 24 h, compared to NDV control group,YPF-P inhibits the virus extremely significant (P<0.01);three ways of medicine compared with NDV control group, cell activity of drug-containing serum groups were increased significantly(P<0.01). YPF-P and drug-containing serum were non-toxic on CEF, and can enhance cell activity significantly ;YPF-P and drug-containing serum has good inhibition of the toxic effects of the virus.

YPF-P ; CEF ; NDV ; YPF-P drug-containing serum ; cell activity

DENG Hua

2016-09-14

廣東省科技計劃項目(2016A020210140);國家級大學生創新創業訓練計劃項目(201411847008)

戴超月(1992-)，男，碩士生，主要從事分子病理學研究，E-mail: 13434818703@163.com

鄧樺，E-mail: denghuatt@163.com

S852.65+9.5

A

0529-6005(2017)07-0030-03