釀酒酵母菌誘導SBD-1mRNA表達的研究

金 鑫 ， 張 曼 ， 田巧珍 ， 劉 驕 ， 王云鶴 ， 楊銀鳳

(內蒙古農業大學獸醫學院 ，內蒙古呼和浩特010018 )

釀酒酵母菌誘導SBD-1mRNA表達的研究

金 鑫 ， 張 曼 ， 田巧珍 ， 劉 驕 ， 王云鶴 ， 楊銀鳳

(內蒙古農業大學獸醫學院 ，內蒙古呼和浩特010018 )

為了探索益生性釀酒酵母菌對綿羊瘤胃上皮細胞β-防御素-1(Sheep Beta-Defensin-1, SBD-1)表達的調節作用。建立綿羊瘤胃上皮細胞培養體系作為體外試驗模型，用不同濃度釀酒酵母菌對體外培養的綿羊瘤胃上皮細胞刺激2 h后分別進行不同時間的誘導培養，然后利用實時熒光定量PCR技術(RT-qPCR)研究接受刺激后瘤胃上皮細胞中SBD-1 mRNA表達的差異。結果表明，在各時間組內，SBD-1 mRNA的表達量隨著菌液濃度的增加均呈先升高后降低的趨勢，當菌液濃度為5.2 × 107CFU/mL時表達量均達到最大，并與對照組和其他濃度組相比差異極顯著(P﹤0.01)。當菌液濃度一定時，SBD-1 mRNA的表達量先是隨著誘導培養時間的延長而呈上升趨勢，誘導培養時間為12 h時SBD-1 mRNA表達量達到峰值，之后呈下降趨勢。因此，當濃度為5.2 × 107CFU/mL的菌液誘導瘤胃上皮細胞12 h時，SBD-1基因的表達量達到最高，且與此濃度下其他時間組的表達量相比差異極顯著(P﹤0.01)。本試驗結果表明，釀酒酵母菌能夠誘導綿羊瘤胃上皮細胞SBD-1的表達，且濃度為5.2 × 107CFU/mL的菌液誘導瘤胃上皮細胞12 h時，SBD-1的表達量達到最高。

β-防御素-1 ； 瘤胃上皮細胞 ； 釀酒酵母菌 ； 實時熒光定量PCR ； 綿羊

防御素是一種存在于生物界中具有廣譜抗微生物活性的陽離子內源性抗菌肽[1]。β-防御素作為防御素家族中的一大成員，廣泛存在于哺乳動物和禽類體內[2-3]，主要由各器官上皮細胞產生[4]。在綿羊體內發現有兩種β-防御素存在，即 SBD-1、SBD-2[5]，通過RT-PCR檢測顯示，SBD-2 mRNA只表達于舌和遠端回腸，而SBD-1 mRNA在氣管和整個消化道都有表達，并且在瘤胃中表達量較多[6-7]。由此提示，β-防御素是綿羊瘤胃天然免疫的重要組成部分。

益生菌作為一種重要的綠色飼料添加劑，已廣泛用于畜禽飼料中以提高動物健康和生產性能[8]。農業部2013年修訂的《飼料添加劑品種目錄》中新增加了4個品種，其中3個與益生性釀酒酵母菌有關(釀酒酵母培養物、釀酒酵母提取物、釀酒酵母細胞壁)[9]，益生菌粘附并定植于腸道上皮細胞是其發揮益生作用的前提，上皮細胞是益生菌發揮益生作用的重要扮演者[10]。而釀酒酵母菌與瘤胃上皮細胞相互作用過程中抗菌肽的表達變化尚未見相關報道，因此本試驗采用RT-qPCR技術檢測釀酒酵母菌對體外培養的綿羊瘤胃上皮細胞SBD-1 mRNA表達的影響。為從益生菌與上皮細胞抗菌肽表達關系的新角度解析防御素發揮非特異性免疫的新途徑和機制提供一定的基礎及依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗動物來自呼和浩特市北亞屠宰場健康狀況良好的綿羊，試驗所用釀酒酵母菌菌株，購自中國微生物菌種網(編號：CGMCC2.161)。

1.2 試驗方法

1.2.1 綿羊瘤胃上皮細胞的原代培養及傳代培養 試驗在借鑒前人[11-13]培養RECs經驗的基礎上，對綿羊RECs的培養方法進行了改進。將瘤胃組織用0.25% 胰酶在37 ℃溫箱中進行不同時間的連續消化，并將所得細胞于37 ℃、5% CO2的培養箱中靜置培養。大約96 h后，培養的上皮細胞已貼壁，此時更換新的完全培養基，之后每兩天換液1次。當原代細胞數量長到細胞培養瓶的80%～90%以上時，便可將細胞進行傳代培養，傳于12孔板用于后續的細胞誘導試驗。

1.2.2 釀酒酵母菌對瘤胃上皮細胞的誘導試驗 將傳代細胞用無血清無抗生素的DMEM/F12培養基進行24 h饑餓處理后，用無雙抗的PBS洗滌3次，然后向細胞板中每孔加入900 μL 的無血清無抗生素的DMEM/F12培養基，并分別加入100 μL濃度為5.2×108、5.2×107、5.2×106、5.2×105、5.2×104CFU/mL的釀酒酵母菌液作為試驗組和DMEM/F12培養基作為空白對照組，置37 ℃溫箱刺激2 h。分別刺激2 h后，吸去培養基，用含兩性霉素B的PBS洗滌3次，重新加入含兩性霉素B、無血清的DMEM/F12培養基以殺死殘存的活菌，繼續誘導培養2、4、8、12、24 h后分別提取各組總RNA。

1.2.3 RT-qPCR 根據GenBank公布的SBD-1基因和管家基因β-Actin序列用DNAStar軟件設計引物，引物序列見表1，并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 實時熒光定量 PCR 引物序列

以cDNA為模板，進行RT-qPCR反應。每個樣品的SBD-1基因和β-Actin基因分別做5個重復。反應結束后，根據擴增曲線的Ct值計算SBD-1基因的相對表達量。

1.2.4 SBD-1 mRNA表達水平的計算 試驗在同一批次細胞內重復5次，將RT-qPCR得到的SBD-1基因和β-Actin基因的Ct值，根據公式2-ΔCt[14]求出添加不同濃度釀酒酵母菌對綿羊瘤胃上皮細胞內SBD-1基因的相對表達量，其中ΔCt=Ct(SBD-1)-Ct(β-Actin)，并進行統計分析。

2 結果

2.1 細胞培養結果 傳代細胞生長迅速，4 d后細胞即有90%以上聚集生長，長成漩渦狀排列的致密單層細胞集落，同時細胞界限較為清晰，胞漿呈顆粒狀，核圓而大(如圖1)。

圖1 綿羊瘤胃上皮細胞培養結果

2.2 釀酒酵母菌對綿羊瘤胃上皮細胞內SBD-1 mRNA相對表達量的影響 數據處理后經SAS9.2軟件分析，結果如圖2所示，當用不同濃度的菌液分別刺激綿羊瘤胃上皮細胞 2 h后繼續誘導培養2、4、8、12、24 h，在各誘導培養時間組內隨著菌液刺激濃度的增加SBD-1 mRNA的表達量均呈先升高后降低的趨勢，當菌液刺激濃度為5.2×107CFU/mL時表達量達到最大，并與對照組和其他濃度組相比差異均極顯著(P<0.01)。當刺激菌液濃度為5.2×104CFU/mL、誘導培養瘤胃上皮細胞4 h時SBD-1 mRNA表達量達到最大，極顯著高于誘導培養2、24 h組(P<0.01)，但與誘導培養8、12 h組相比差異不顯著(P>0.05)。當菌液刺激濃度為5.2×105、5.2×106、5.2×107、5.2×108CFU/mL時，SBD-1 mRNA的表達量隨著誘導培養時間的延長而呈上升趨勢，誘導培養時間為12 h時SBD-1 mRNA表達量達到最大，之后呈下降趨勢。因此，當刺激濃度為5.2×107CFU/mL的菌液誘導培養瘤胃上皮細胞12 h時，SBD-1基因的表達量達到最高，且與此濃度下其他誘導培養時間組的表達量相比差異均極顯著(P<0.01)。

圖2 釀酒酵母菌對瘤胃上皮細胞SBD-1 mRNA表達的時間和濃度依賴關系**：P < 0.01，與空白組比較

3 討論

為了揭示益生菌濃度、刺激時間、防御素表達量三者之間的關系，本試驗從mRNA水平對SBD-1基因進行檢測，結果發現，釀酒酵母菌誘導綿羊瘤胃上皮細胞SBD-1的表達作用存在劑量—時間依賴關系，但濃度過低或過高都會使SBD-1 基因表達效果降低，當菌液濃度為5.2×107CFU/mL誘導瘤胃上皮細胞12 h時SBD-1基因的表達量達到最高。2008年Schlee等[15]研究發現，不同的益生乳酸菌株與人β-防御素-2(HBD-2)的表達量存在劑量—時間依賴關系，HBD-2 mRNA表達量隨著不同益生菌液劑量增大而增加，且刺激6 h后達到峰值。2012年黎觀紅等[16]發現用菌液濃度為2×106CFU/mL的鼠李糖乳酸桿菌LGA對體外培養的雞小腸上皮細胞刺激12 h，表達量達到峰值。本試驗結果與以上兩人的研究結果基本相同，但當抗菌肽達到最高表達量時所用的菌液濃度和刺激時間卻存在差異，這可能是由于試驗動物種屬間存在差異和不同菌體具有不同的有效刺激成分有關。

綜合本試驗結果可以推斷，益生性釀酒酵母菌促進或誘導綿羊瘤胃內SBD-1基因的表達可能是其發揮益生作用尤其是免疫促進作用的一種重要作用方式。釀酒酵母菌通過上調綿羊瘤胃上皮細胞SBD-1基因的表達而提高瘤胃天然免疫功能。因此，益生性釀酒酵母菌可能通過誘導或促進瘤胃抗菌肽的表達在黏膜局部形成高濃度，從而抑制和殺滅瘤胃內有害菌并調節有益菌數量和種類以維持瘤胃微生態平衡。同時，瘤胃上皮細胞分泌的抗菌肽可作為細胞間的信號分子發揮多重免疫調節作用。

4 結論

本試驗結果在印證益生菌能夠誘導人和哺乳動物胃腸道上皮細胞抗菌肽表達的同時，進一步從mRNA水平得出了釀酒酵母菌能夠提高綿羊瘤胃上皮細胞SBD-1基因的表達，且濃度為5.2×107CFU/mL的菌液誘導瘤胃上皮細胞12 h時SBD-1基因的表達量達到最高。

[1] Semple F, Dorin J R.β-Defensins: Multifunctional Modulators of Infection, Inflammation and More[J]. Journal of Innate Immunity, 2012, 4: 337-348.

[2] Meade K G, Cormican P, Narciamdi F,etal.Bovine β-defensin gene family: opportunities to improve animal health[J]. Physiological Genomics, 2014, 46(1): 17-28.

[3] Xiao Y, Hughes A L, Ando J,etal. A genome-wide screen identifies a single beta-defensin gene cluster in the chicken: implications for the origin and evolution of mammalian defensins[J]. BMC Genomics, 2004, 5(1): 56.

[4] Zhao P W, Cao G F. Production of bioactive sheep β-defensin-1 in Pichia pastoris[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2012, 39(1): 11-17.

[5] Monteleone G, Calascibeffa D, Scaturro M,etal.Polymorphisms of β-defensin genes in Valle del Belice dairy sheep[J]. Molecular Biology Reports, 2011, 38(8): 5 405-5 412.

[6] 盛金良, 陳創夫, 楊霞. 綿羊防御素(sBD1)mRNA在不同發育階段的組織分布和定量分析[J]. 畜牧獸醫學報, 2009, 40(1): 20-25.

[7] 李硯, 楊銀鳳. 家畜體內防御素的多態性和表達[J]. 中國畜牧獸醫, 2013, 40(3): 160-168

[8] 洪智敏, 張和平, 賈永杰, 等. 發酵乳酸桿菌F6對雞小腸上皮細胞β-防御素-9基因表達的影響[J]. 中國獸醫學報, 2012, 32(8): 1 142-1 147.

[9] 中華人民共和國農業部公告第2045號[J]. 中國飼料, 2014(2): 1-4.

[10] Galdeamo C M, Demoreno D L A, Viderola G,etal. Proposed model: mechanisms of immunomodulation induced by probiotic bacteria[J]. Clin Vaccine Immunol, 2007, 14(5): 485-492.

[11] Klotz J L, Baldwin R L, Gillis R C,etal. Refinements in primary rumen epithelial cell incubation techniques[J]. Journal of Dairy Science, 2001, 84(1): 183-193.

[12] 孫志洪, 張慶麗, 賀志雄, 等. 山羊瘤胃上皮細胞和空腸黏膜上皮細胞原代培養技術研究[J]. 動物營養學報, 2010, 22(3): 602-610.

[13] 范燕茹, 王佩, 金鑫，等. 中國馴鹿瘤胃上皮細胞的體外分離培養[J]. 黑龍江畜牧獸醫, 2014(11): 8-10.

[14] Schmittgen T D, Zakrajsek B A. Effect of experimental treatment on housekeeping gene expression:validation by real-time,quantitative RT-PCR[J]. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2000, 46 (1-2): 69-81.

[15] Schlee M, Harder J, Koten B,etal. Probiotic lactobacilli and VSL#3 induce enterocyte beta-defensin 2[J]. Clinical and Experimental Immunology, 2008, 151(3): 528-535.

[16] 黎觀紅, 洪智敏, 賈永杰. 鼠李糖乳酸桿菌LGA對雞小腸上皮細胞β-防御素-9基因表達的影響[J]. 畜牧獸醫學報, 2012, 43(4): 634-641.

Study on the expression of SBD-1 mRNA induced by Saccharomyces cerevisiae

JIN Xin , ZHANG Man , TIAN Qiao-zhen , LIU Jiao , WANG Yun-he , YANG Yin-feng

(College of veterinary, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

In this study，we investigated the effect of probioticSaccharomycescerevisiaeon the β-defensin-1 (Sheep Beta-Defensin-1, SBD-1) expression in cultured ruminal epithelial cells of sheep. The ruminal epithelium cells(RECs) of sheep were cultured successfully in vitro, and the RECs were stimulated 2 h with different concentrations ofSaccharomycescerevisiae, and then for different times. Then the expression of SBD-1 mRNA was analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR(RT-qPCR). The results showed that the expression of SBD-1 mRNA in each time group were increased and then decreased following the increase of Saccharomyces cerevisiae concentrations.The expression of SBD-1 mRNA was highest and significantly higher than the control group and the other concentration groups (P< 0.01). When the cells were stimulated with the concentration of 5.2 × 107CFU·mL-1. When the concentration was constant, the expression of SBD-1 mRNA was increased with the extension of stimulating time, and the expression of SBD-1 mRNA was the highest at 12 h. Therefore, the expression of SBD-1 was the highest when the concentration of Saccharomyces cerevisiae was at 5.2 × 107CFU·mL-1and the stimulating was 12 h stimulating, compared with the other time groups at this concentration (P< 0.01). These findings indicate thatSaccharomycescerevisiaecan induce the expression of SBD-1 in ruminal epithelial cells of sheep. And the level of SBD-1 expression is highest when the rumen epithelial cells are stimulated with the concentration of 5.2×107CFU·mL-1for 12 h.

β-defensin-1 ; ruminal epithelial cells ;Saccharomycescerevisiae; realtime fluorescence quantitative PCR ; sheep

YANG Yin-feng

2016-09-29

金鑫(1990-)，男，博士，從事動物解剖及黏膜免疫工作，E-mail：jinxinnndsyxy@163.com

楊銀鳳，E-mail：julie1963@163.com

S826

A

0529-6005(2017)07-0010-03