“熒光顯微術原理及應用”的教學與思考

房克鳳

摘要 “熒光顯微術原理及應用”是基于北京農學院現有研究生課程的基礎上面擬向農業生產類、生物專業、動物專業以及園林專業的碩士研究生設置的選修課，其目的在于為研究生進行正式學術研究打下一定的實驗技術基礎。主要講述體式熒光顯微鏡、熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡的原理及應用。根據學校新修改的研究生課程設置的精神，進行精講多練。總27學時，其中7學時理論，20學時實驗。通過本課程的開設，使得研究生能夠掌握體式熒光顯微鏡、熒光顯微鏡以及激光掃描共聚焦顯微鏡的原理和使用，為科研工作的順利進行打下堅實的基礎。

關鍵詞 熒光顯微術 課程 教學 思考

中圖分類號：G424 文獻標識碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdks.2017.05.074

“熒光顯微術原理及應用”是一門非常重視實踐性的技術基礎課。“熒光顯微術原理及應用”是基于北京農學院現有研究生課程的基礎上擬向農業生產類、生物專業、動物專業以及園林專業的一年級碩士研究生開設的公共選修課，希望通過該課程的開設，為研究生開展學術研究奠定一定的實驗技術基礎。該課程對于研究生掌握科學研究中的細胞生物學觀察方法，培養學生獨立進行科學研究的素養和能力具有重要作用。作為新開研究生課程，基于北京農學院的實際情況對“熒光顯微術原理及應用”的教學與實驗進行了如下設置及思考。

1“熒光顯微術原理及應用”課程開設的必要性

1.1研究手段和技術的發展的需要

物質吸收電磁輻射后進入激發態，而受到激發的原子或分子在去激發過程中再發射波長比激發光波長更長的光，這種再發射的光稱為熒光。生物體內有些物質有自發熒光，如葉綠素或細胞壁的某些成分，受紫外線照射后發出熒光；生物體內大部分物質本身不能發出熒光，但如果用特異性的熒光染料標記后，經紫外線或其他波長的光照射后也可以發出熒光，這種熒光可以被熒光顯微鏡捕獲，并進行定量分析。因此，熒光顯微術就是基于熒光對這類物質進行研究的技術。熒光顯微鏡依據觀察物體大小及原理又可以分為多種。常用的有體式熒光顯微鏡、熒光顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡等等。

體視熒光顯微鏡能對微小樣品進行快速、清晰的顯微觀察，并實現完全無漂移的三維立體成像，配有較長的工作距離，不僅能夠獲得較大的景深和光學細節，還能保證樣品的真實色彩；對樣品能進行實體測量；具有良好的操控系統，可提供優良的重復性從而使實驗過程簡化。但是體式熒光顯微鏡有缺陷性。其放大倍率較低，適合于研究對象的整體觀察和活體觀察以及一些較大的器官和組織的觀察，不適合觀察小組織或細胞。

與體式熒光顯微鏡相比，熒光顯微鏡放大倍數較高，工作距離較短。可以觀察更多的細節。能在組織、細胞和亞細胞的水平上研究細胞內物質的定位、營養成分的吸收、運輸，以及化學物質的分布及定位等。可以進行活體或固定材料的觀察。

激光掃描共聚焦顯微鏡是上個世紀80年代發展起來的一種非常精密的儀器設備。它以光學為基礎，將機械、電子、計算機等融為一體。與體式熒光顯微鏡和熒光顯微鏡不同，激光共聚焦以激光為光源，可以把標本分成多個光學斷層，逐層進行掃描并成像，因此是一種新顯微層面的研究手段。此外，由于激光共聚焦顯微鏡對細胞和組織連續光學切片無損傷，而且能夠對活體細胞進行實時的動態觀察，使它在生物科學的研究中占有獨特的地位。目前，人們已廣泛應用該技術來觀察和分析細胞內的微細結構和分子在細胞內的分布，例如細胞內游離鈣、活性氧、轉錄因子、表面分子、細胞凋亡、細胞膜流動性、胞內分子的運動、細胞間的縫隙連接、蛋白問的相互作用等方面。

傳統的熒光顯微鏡配備的是膠卷相機，膠卷的沖洗非常復雜、耗時耗力。隨著科學技術的發展，數字成像系統也應用到熒光顯微術上。其中電荷耦合元件（Charge-coupled Device，CCD）就是與熒光顯微鏡密切相關的數碼攝像產品。它能夠將熒光顯微鏡拍攝的顯微攝影產品通過USB接口傳輸到電腦中，便于圖像的采集研究。隨著技術的進一步發展，分辨率也越來越高，因此通過CCD，可以拍攝到分辨率更高的圖片。

1.2課程設置的需要

根據本校研究生現有課程以及科研工作的需要，特開設“熒光顯微術原理及應用”。現有的課程“植物顯微技術”注重石蠟切片，尤其是實驗環節甚少涉及顯微鏡；而現有的“電子顯微鏡”課程主要講述超薄切片和透射電鏡以及掃描電鏡的原理及使用。因而“熒光顯微術原理及應用”課程的開設，填補了兩者之間的空檔，能夠更好地為廣大教師和研究生的科學研究工作服務。

1.3科學研究的需要

隨著學校教師科研項目的增多、科學研究的深入，越來越需要使用相應的技術手段，例如研究特定基因功能，需要進行轉基因驗證，一般加入GFP，YFP等報告基因，此時需在激光掃描共聚焦顯微鏡下進行觀察將基因表達的蛋白進行定位并分析。

1.4現有實驗平臺的支持

北京農學院農業應用新技術北京市重點實驗室下設三個研究平臺，其中顯微平臺具備體式熒光顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、正置熒光顯微鏡和Leiea的激光掃描共聚焦掃描顯微鏡等大型儀器設備，為本課程的順利開設提供了物質基礎。

1.5教輔人員的配備

開設本課程的教師具有多年教學經驗以及多年管理體式熒光顯微鏡、正置熒光顯微鏡、倒置熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡等設備的經驗，為本課程的順利開設奠定了理論和實踐基礎。

2安排合理的教學和實驗內容

2.1理論與實踐相結合的教學理念

熒光顯微術具有非常強的技術性和應用性，但理論知識的學習也是必不可少的。掌握了理論知識，能夠促進實踐應用。利用熒光進行顯微觀察的顯微鏡有許多種，根據本校的設備基礎結合教師們的研究需求，重點選擇體式熒光顯微鏡、熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡等內容。首先，要進行相關的理論講解，使研究生們掌握理論基礎，在此基礎上設計一些獨立、完整的小實驗，使學生能夠掌握相應儀器的使用方法。例如利用體式熒光顯微鏡進行轉基因材料的鑒定。體式熒光顯微鏡具有較大的景深，能夠非常方便地觀察轉綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白的轉基因材料，如草莓、番茄、板栗、海棠、百合、玉米等。大大簡化了原來在顯微鏡下觀察的繁瑣的前處理過程。

2.2選擇合適的教學內容

根據研究生的研究需求結合學術發展的進展，選擇合適的教學內容。理論課程內容主要分為五個部分。第一部分顯微鏡的發展簡史。包括顯微鏡的發展，熒光的發現、發展、選擇及使用、熒光蛋白的發現、發展和使用等等。第二部分為體式熒光顯微鏡，包括其理論及應用。第三部分為熒光顯微鏡，包括理論及應用。第四部分為激光掃描共聚焦顯微鏡的理論和應用。第五部分：其他熒光顯微技術，如更為先進的雙光子熒光顯微鏡、轉盤激光掃描共聚焦顯微鏡等內容。

2.3設置合理的實驗內容

教學中想盡辦法引導學生把理論知識和其自身的科學研究有機結合，提高學生的興趣和對知識的掌握能力。基于本校農業應用新技術北京市重點實驗室顯微平臺的儀器設備配置情況，結合研究生研究課題的需求，設置相應的較為系統性的小實驗。

體式熒光顯微鏡因其景深較大，可以觀察較大的實驗材料。例如可以觀察本校不同研究團隊的轉基因材料以及較大的組織塊等。前期已經成功觀察到了根的轉基因熒光。

熒光顯微鏡觀察花粉管內囊泡運輸。首先需要選擇合適的花粉。不同物種的花粉其萌發時間及生長速度差異巨大，要選擇生長速度合適的花粉。首先要培養花粉管，其次用熒光染料FM 4-64標記囊泡，在此過程中需要學生分組合作，配置所需試劑，隨后在顯微鏡下觀察花粉萌發及花粉管生長情況。接著選擇合適的花粉管，用熒光染料FM 4-64標記囊泡，隨后在熒光顯微鏡下觀察囊泡運輸情況并采集圖像，利用軟件對熒光進行定量分析，得出相應結論，撰寫實驗報告。

利用激光共聚焦顯微鏡采集花粉管內游離鈣離子信號。植物細胞因具細胞壁，鈣離子標記較為復雜，時間較長，能夠鍛煉研究生的動手能力。花粉管培養完畢后用Fluo 4 AM標記鈣離子，用xyt的模式觀察鈣離子的動態變化，利用軟件進行熒光定量分析，得出相應結論，撰寫實驗報告。

3考核方式的探索

根據本門課程注重實驗的特點，以及出于對學生基本實驗技能、創新意識、創造性思維、科學思想、科學態度等進行全面評價，總成績評定由三部分組成：（1）上課及參加實驗的考勤（占30%）；（2）自己制作并進行顯微觀察的圖片質量（占40%）；（3）實驗報告寫作及其對實驗中出現問題的分析情況（占30%）。課程論文內附有學生自己拍攝的自己制作的切片的顯微照片，以及對照片出現的問題分析。

4結語

“熒光顯微術原理及應用”課程的特點是具有非常強的實踐性，對學生的科學態度、動手能力及分析問題和解決問題的能力要求較高。因此，為了讓學生在較短的時間內接受嚴格的正規訓練，整個實驗過程讓學生獨立操作，最后獲取圖片后，對樣品內容、樣品質量和圖片質量進行綜合分析，最后完成實驗報告，能夠較大地提高了研究生進行科學研究的綜合能力。