基于光解籠鎖谷氨酸的離體癲癇模型建立

鄭茜茜，陳亮亮，葉學(xué)松

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.浙江大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310027）

·論 著·

基于光解籠鎖谷氨酸的離體癲癇模型建立

鄭茜茜1，陳亮亮1，葉學(xué)松2

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.浙江大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310027）

目的：建立離體癲癇模型模擬癲癇發(fā)作，更好地研究癲癇發(fā)病的內(nèi)在機(jī)制。方法：針對(duì)目前電刺激和藥物干預(yù)存在的缺陷，建立了基于光解籠鎖谷氨酸的神經(jīng)元細(xì)胞刺激系統(tǒng)，并以培養(yǎng)在微電極陣列（MEA）上的海馬神經(jīng)元作為研究對(duì)象。特定波長(zhǎng)的紫外光經(jīng)光學(xué)聚焦系統(tǒng)聚焦后，照射到籠鎖谷氨酸電解液中，解除光敏基團(tuán)的籠鎖作用，釋放出谷氨酸。結(jié)果：紫外光未作用時(shí)海馬神經(jīng)元呈現(xiàn)正常的電位發(fā)放；紫外光激發(fā)后釋放出谷氨酸，海馬神經(jīng)元呈現(xiàn)癲癇樣放電。結(jié)論：初步建立了離體癲癇模型，為癲癇發(fā)病機(jī)制的研究提供了理性的離體模型。

光刺激；籠鎖谷氨酸；海馬神經(jīng)元；離體癲癇模型；微電極陣列

癲癇是發(fā)病率較高的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，難治性癲癇中顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy，TLE）是最常見(jiàn)的，大量研究表明TLE的發(fā)生可能與海馬和邊緣系統(tǒng)之間復(fù)雜的興奮性連接環(huán)路以及海馬結(jié)構(gòu)變化[1]有關(guān)。谷氨酸與癲癇發(fā)作關(guān)系密切[2]，因此谷氨酸誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元組群離體癲癇模型的建立對(duì)研制抗癲癇藥物具有一定的意義。目前神經(jīng)細(xì)胞的刺激主要通過(guò)電刺激[3]和藥物干預(yù)[4]來(lái)實(shí)現(xiàn)。雖然電刺激施行方便，可精確控制，但難以實(shí)現(xiàn)多點(diǎn)同時(shí)刺激。針對(duì)產(chǎn)生的刺激偽跡，可通過(guò)一些處理方法[5]來(lái)消除，但是傳播的不受控制仍然是一大缺陷。藥物干預(yù)由于受加藥方式和藥物擴(kuò)散等影響，時(shí)間和空間精度、細(xì)胞特異性不高。為了克服上述缺陷，本研究采用光解籠鎖（uncaging）技術(shù)作為研究神經(jīng)活動(dòng)的新方法。本研究在微電極陣列（microelectrode array，MEA）芯片上離體培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，使用特定波長(zhǎng)的紫外光照射籠鎖谷氨酸，釋放出谷氨酸，誘發(fā)海馬細(xì)胞產(chǎn)生癲癇樣放電，建立離體神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)癲癇模型，進(jìn)而探索癲癇的發(fā)病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)：取孕齡18 d的Wistar大鼠（由浙江大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），根據(jù)文獻(xiàn)[6]常規(guī)分離原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元。6 d后海馬神經(jīng)元初步形成網(wǎng)絡(luò)，可進(jìn)行下一步的記錄和實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 光解籠鎖刺激系統(tǒng)：籠鎖化合物（caged compound）是一類人工合成的功能被屏蔽的生物活性化合物，一旦被特定波長(zhǎng)的光照射，隱蔽基團(tuán)的籠鎖作用被解除，釋放出活性分子，這一過(guò)程稱為光解籠鎖。本研究使用特定波長(zhǎng)的紫外光照射籠鎖谷氨酸，解除光敏基團(tuán)的籠鎖作用，在光照的特定部位釋放出谷氨酸，誘發(fā)海馬細(xì)胞產(chǎn)生癲癇樣放電，整個(gè)刺激系統(tǒng)見(jiàn)圖1。在本研究中用375 nm的紫外光激發(fā)MNI-籠鎖谷氨酸（4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged-glutamate，由CANEPARI等[7]合成的）。光解籠鎖前，MNI-籠鎖谷氨酸溶液的濃度被電解液（NaCl 148 mmol/L，KCl 2.8 mmol/L，MgCl22 mmol/L，CaCl22 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，pH 7.2～7.4）稀釋到1 mmol/L。由光纖引導(dǎo)的紫外光經(jīng)光學(xué)聚焦系統(tǒng)（由兩片平凸石英透鏡構(gòu)成）聚焦后，傳遞到電解液中進(jìn)行解籠鎖。光纖的出射端連接到一個(gè)薄的鋼桿上，并固定在三維微操縱器上，利用微操縱器把光纖的尖端移至目標(biāo)神經(jīng)元附近。微操縱器安裝在防振臺(tái)上的倒置顯微鏡上。為了控制紫外光脈沖的頻率和持續(xù)時(shí)間，利用信號(hào)發(fā)生器產(chǎn)生一個(gè)方波信號(hào)，并傳遞到激光光源，整個(gè)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)見(jiàn)圖2。

圖1 光刺激電記錄及其檢測(cè)系統(tǒng)示意圖

1.2 方法

1.2.1 光纖尖端的制作：為得到一個(gè)高分辨率的紫外線光斑，光纖的尖端被化學(xué)腐蝕成錐形，具體操作步驟見(jiàn)圖3。用于制備裸光纖錐的石英玻璃光纖（纖芯直徑200 μm，覆蓋層直徑280 μm，數(shù)值孔徑0.22）末端被光纖切刀切斷，去除覆蓋層，浸入氫氟酸（HF）溶液（50 mL 40%的HF溶液加入到50 mL的水中）中進(jìn)行濕化學(xué)腐蝕，見(jiàn)圖3A。為了防止HF揮發(fā)，利用甲基硅油對(duì)HF溶液的表面進(jìn)行密封，將近6 h的腐蝕后，光纖尖端被腐蝕成錐形，見(jiàn)圖3B。同時(shí)也暴露了光纖核心的一部分，導(dǎo)致了橫向光的泄露和發(fā)射光斑的擴(kuò)大。因此，為了防止橫向光泄露，光纖尖端還需要覆蓋上一層銀膜，見(jiàn)圖3C。把光纖尖端浸泡在銀浴中（溶液A和溶液B的混合物，A：在35 mg/mL的AgNO3中添加28%的NH3·H2O；B：95 mL 99%乙醇，1.1 mL 38%甲醛和3.9 mL去離子水的混合物）。銀涂層后，光纖再浸泡到硝酸中去除出射端的銀層，見(jiàn)圖3D。制作完成的光纖尖端見(jiàn)圖3E。

圖2 實(shí)驗(yàn)平臺(tái)實(shí)物圖

圖3 光纖尖端的制作過(guò)程

1.2.2 實(shí)驗(yàn)參數(shù)的選擇：籠鎖化合物濃度、刺激波長(zhǎng)、刺激功率和刺激時(shí)間都會(huì)影響光解籠鎖后的光斑面積[8]。MNI-籠鎖谷氨酸的活化光譜范圍為300～380 nm，本研究中選用的刺激波長(zhǎng)為375 nm，因?yàn)槟壳笆袌?chǎng)上375 nm的激光器比較容易獲得；MNI-籠鎖谷氨酸溶液濃度是1 mmol/L。

1.2.3 MEA記錄系統(tǒng)：為記錄谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元電活動(dòng)，實(shí)驗(yàn)采用集成MEA記錄系統(tǒng)（60MEA200/30-Ti，多通道系統(tǒng)）。在MEA芯片表面粘合玻璃圓環(huán)形成培養(yǎng)腔，MNI-籠鎖谷氨酸溶液（前面提到的被電解液稀釋到1 mmol/L的籠鎖谷氨酸溶液）倒入培養(yǎng)腔中。在解籠鎖期間，60個(gè)通道同時(shí)獲得電信號(hào)，采樣頻率為50 kHz。帶通濾波器（300～2 000 Hz）對(duì)信號(hào)進(jìn)行濾波。

2 結(jié)果

2.1 光解籠鎖實(shí)驗(yàn)結(jié)果 為了研究刺激時(shí)間對(duì)光解籠鎖后光斑面積的影響，利用籠鎖熒光素進(jìn)行模擬。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：刺激時(shí)間越長(zhǎng)，形成的光斑越大。刺激光功率為1 mW，不同刺激時(shí)間（50 ms、100 ms、200 ms和500 ms）引起的熒光光斑見(jiàn)圖4。經(jīng)比較后，本研究選用的刺激功率為1 mW，刺激時(shí)間為50 ms，產(chǎn)生的光斑大小為（22.77±2.01）μm，與海馬神經(jīng)元細(xì)胞尺寸相近。

圖4 熒光光斑面積和刺激時(shí)間之間的關(guān)系

2.2 離體培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò) 培養(yǎng)6 d后海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)在MEA芯片表面形成。可以看出細(xì)胞胞體增大，突起增多，呈現(xiàn)三角形或者橢圓形，并和周圍的神經(jīng)元通過(guò)突觸連接形成網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖5。

圖5 在培養(yǎng)瓶（A）和MEA芯片（B）上培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)（×200）

2.3 谷氨酸誘發(fā)的癲癇樣放電 紫外光未作用時(shí)記錄到2個(gè)海馬神經(jīng)元正常的電位發(fā)放，見(jiàn)圖6A和6C；實(shí)驗(yàn)中可以觀察到有些神經(jīng)元細(xì)胞除了動(dòng)作電位還有一些自發(fā)的突觸后電位，見(jiàn)圖6A；海馬神經(jīng)元細(xì)胞有一些自發(fā)的爆發(fā)現(xiàn)象，見(jiàn)圖6C。經(jīng)紫外光激發(fā)后這2個(gè)海馬神經(jīng)元都呈現(xiàn)癲癇樣放電，見(jiàn)圖6B和6D，確定該癲癇模型建立成功。

圖6 谷氨酸誘發(fā)的海馬神經(jīng)元癲癇樣放電

3 討論

目前關(guān)于神經(jīng)系統(tǒng)刺激的方法很多，但把光作為調(diào)控手段的不是很多；本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[9-11]，成功研制了基于光解籠鎖谷氨酸的神經(jīng)元細(xì)胞刺激系統(tǒng)，彌補(bǔ)電刺激方法刺激不可控的缺陷。MNI-籠鎖谷氨酸解籠鎖后，現(xiàn)象不明顯，難以觀察解籠鎖和上述因素的關(guān)系，因此利用籠鎖熒光素進(jìn)行模擬，研究刺激時(shí)間的影響。籠鎖熒光素解籠鎖后會(huì)產(chǎn)生熒光效應(yīng)，通過(guò)CCD（charge coupled device）相機(jī)觀察解籠鎖后出現(xiàn)的熒光光斑，并利用此系統(tǒng)成功誘發(fā)培養(yǎng)在MEA芯片上的海馬神經(jīng)元組群癲癇樣放電，初步建立離體癲癇模型，有利于人們探索癲癇發(fā)病機(jī)制以及研制抗癲癇藥物。本實(shí)驗(yàn)還研究了谷氨酸興奮性毒性可能會(huì)給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的影響。谷氨酸的過(guò)度激活會(huì)傷害甚至殺死神經(jīng)元。TORIMITSU和NIWA[12]發(fā)現(xiàn)籠鎖谷氨酸的濃度在激光輻射期顯示出線性相關(guān)性。在本研究中，根據(jù)紫外光的照射時(shí)間，谷氨酸的峰值濃度大概是20 μmol/L，這遠(yuǎn)低于GARTHAITE等[13]提到的有毒濃度。同時(shí)，本研究建立的刺激系統(tǒng)同樣可廣泛適合于神經(jīng)細(xì)胞電生理和神經(jīng)生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)。

盡管初步建立了離體癲癇模型，但是本研究很多地方仍然處于探索階段，在下一步研究中，需要改進(jìn)的地方有：①將利用微流控技術(shù)引導(dǎo)細(xì)胞定向生長(zhǎng)，建立不同的拓?fù)溥B接結(jié)構(gòu)，利用光解籠鎖谷氨酸刺激系統(tǒng)，在光照的特定部位（如神經(jīng)元胞體、神經(jīng)突觸等局部位置）釋放出谷氨酸，研究不同拓?fù)溥B接結(jié)構(gòu)的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)在谷氨酸作用下的放電情況，闡明網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、突觸連接與癲癇發(fā)作的內(nèi)在機(jī)制；②根據(jù)海馬神經(jīng)系統(tǒng)的解剖結(jié)構(gòu)，首先建立單個(gè)神經(jīng)元仿真模型，包括錐體細(xì)胞和中間神經(jīng)元；然后建立各個(gè)神經(jīng)元之間的突觸連接（興奮性和抑制性突觸），形成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)仿真模型。通過(guò)將仿真結(jié)果與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相比較，優(yōu)化網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和參數(shù)，獲得與實(shí)際觀察相符合的網(wǎng)絡(luò)模型，在細(xì)胞水平上闡明癲癇發(fā)作的內(nèi)在機(jī)制。

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（本文編輯：吳彬）

Establishment of the epilepsy model in vitro based on optical release of caged-glutamate

ZHENG Qian qian1, CHEN Liangliang1, YE Xuesong2.
1.College of Biomedical Engineering, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.College of Biomedical Engineering & Instrument Science, Zhejiang University, Hangzhou, 310027

Objective:In order to better study the internal mechanism of the seizure, the epilepsy model in vitro was established to simulate seizure discharge.Methods:Aiming at the drawbacks of the electrical stimulation and drugs intervention, a stimulation system of neurons based on optical release of caged-glutamate was developed. The hippocampal neurons cultured on the microelectrode array were used as the research object. The ultraviolet (UV) focused by the optical focus system was delivered to the bath solution contained cage-glutamate. Using a specifi c wavelength of UV to remove the caged function of photosensitive groups, glutamate was released.Results:The hippocampal neurons showed the normal potential when the UV did not work. The glutamate induced seizure discharge in the hippocampal neurons after the UV excitation.Conclusion:The epilepsy model in vitro was preliminarily set up. The model provides the rational model in vitro for the researches on the mechanism of the epilepsy.

optical stimulation; caged-glutamate; hippocampal neurons; the epilepsy model in vitro; microelectrode array

R318.6

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.07.009

2016-09-09

浙江省教育廳訪問(wèn)學(xué)者教師專業(yè)發(fā)展項(xiàng)目；溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（G20150022）。

鄭茜茜（1978-），女，浙江溫州人，講師，碩士。