miR-21在人骨肉瘤細胞系U2OS體外侵襲中的作用及其機制

呂晨，陳鑫，朱雄白，林文軍，王路，黃正湘，楊勝武

（溫州醫科大學附屬第一醫院 骨科，浙江 溫州 325015）

·論 著·

miR-21在人骨肉瘤細胞系U2OS體外侵襲中的作用及其機制

呂晨，陳鑫，朱雄白，林文軍，王路，黃正湘，楊勝武

（溫州醫科大學附屬第一醫院 骨科，浙江 溫州 325015）

目的：探討miR-21在人骨肉瘤細胞系U2OS體外侵襲中的作用及其機制。方法：培養人正常成骨細胞系hFOB 1.19和人骨肉瘤細胞系U2OS，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）比較2組細胞miR-21的表達差異。通過miR-21-up慢病毒感染U2OS細胞，qRT-PCR檢測感染前后U2OS細胞中miR-21的表達變化。Transwell侵襲實驗檢測miR-21對U2OS細胞侵襲的影響，并通過Western blot檢測驗證在U2OS細胞中miR-21對于靶基因PTEN是否具有調控作用及miR-21對U2OS細胞中侵襲相關蛋白基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9表達的影響。結果：qRT-PCR結果表明miR-21在骨肉瘤細胞系U2OS中高表達（P＜0.05）。Transwell檢測結果表明上調miR-21的表達能夠明顯促進U2OS細胞的侵襲（P＜0.05）。Western blot檢測表明PTEN在骨肉瘤細胞中低表達，且與miR-21表達呈負相關（P＜0.05）。miR-21可促進侵襲相關蛋白MMP-2、MMP-9的表達（P＜0.05）。結論：miR-21可通過抑制PTEN蛋白的表達，進而促進侵襲相關蛋白MMP-2、MMP-9的表達，促進人骨肉瘤細胞系U2OS的侵襲。

miR-21；骨肉瘤；PTEN；基質金屬蛋白酶；侵襲

骨肉瘤是一種好發于兒童和青少年的骨原發性惡性腫瘤，約占兒科腫瘤的5%[1]，男性發病率略高于女性。骨肉瘤好發于長管狀骨的干骺端，以股骨遠端和脛骨近端最多見。骨肉瘤惡性程度高，預后極差。近年來，隨著輔助檢查和手術技術的提高，特別是新的化療藥物的使用，骨肉瘤5年生存率從20%提高到70%。然而，由于骨肉瘤早期就可出現肺部轉移，臨床單純骨肉瘤截肢術后患者的5年生存率仍然不容樂觀[2-3]。目前，骨肉瘤侵襲和轉移的具體分子機制仍未明確。因此，迫切需要尋找一種新的可以預測腫瘤進展的有效分子標記物，探討其作用機制，并用于指導臨床預后。

microRNA（miRNA）是一類存在于動植物以及病毒中可調控基因表達的內源性非編碼單鏈小分子RNA，長21～23個核苷酸。研究[4]表明miRNA可通過與其靶基因mRNA 3’端非翻譯區完全或部分的匹配結合，使后者降解或抑制其翻譯過程，從而發揮調控基因表達的作用。研究表明，miRNA和骨肉瘤的發生發展以及耐藥性有著密切的關系[5-6]。根據文獻[7]報道，多種腫瘤標本以及細胞系都檢測出miR-21表達水平的異常升高，包括神經系統腫瘤、消化系統腫瘤、婦科腫瘤、生殖系統腫瘤等，因此miR-21是目前公認的一個致癌性miRNA。但目前有關miR-21與骨肉瘤的相關性研究甚少。為了更好地探究miR-21在骨肉瘤進展中的作用，本研究通過比較miR-21在正常人成骨細胞系hFOB 1.19和人骨肉瘤細胞系U2OS中的表達差異，以及通過上調miR-21的表達，研究miR-21的表達對骨肉瘤細胞侵襲的影響，并對miR-21調控骨肉瘤細胞侵襲的機制進行初步的探討，為骨肉瘤的靶向治療提供新的理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞和主要試劑：人正常成骨細胞系hFOB 1.19由SUBRAMANIAM博士惠贈[8]，人骨肉瘤細胞系U2OS購自中國科學院上海細胞研究所，胎牛血清、DMEM/F12培養基、DMEM/High-glucose培養基、0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素等購自美國Gibco公司，pGCMV-rno-miR-21-up慢病毒表達載體購自上海吉凱基因技術有限公司，Hairpin-itTMmiRNAs RT-PCR Quantitation試劑盒（探針法）購自上海吉瑪制藥技術有限公司，兔抗大鼠PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosometen）單克隆抗體購自美國CST公司，兔抗大鼠基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2/9多克隆抗體購自美國Protein Tech公司，兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體購自北京康為世紀生物有限公司，HRP標記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物有限公司，Transwell小室購自美國Millipore公司，結晶紫購自北京索萊寶生物技術公司。

1.1.2 主要儀器：超凈工作臺、CO2培養箱、倒置顯微鏡、培養皿、孔板、微量加樣器、37 ℃水浴箱、4/-20 ℃冰箱、-80 ℃冰箱、低速離心機、PCR擴增儀、羅氏480熒光定量PCR儀、ECL發光系統等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：人正常成骨細胞系hFOB 1.19采用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基培養，人骨肉瘤細胞系U2OS采用含10%胎牛血清的DMEM/Highglucose培養基培養；2組細胞均放置于含5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中。細胞每2 d換液1次，當貼壁細胞融合度達80%左右用胰酶消化制成細胞懸液，按1:3傳代。

1.2.2 miR-21-up慢病毒感染人骨肉瘤細胞系U2OS：將對數生長期的U2OS細胞接種于6孔板（密度約3× 104/mL），于含5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后細胞融合度達到30%～50%。 配置病毒感染液：miR-21-up慢病毒（1860-5，miR-21-up）20 μL，陰性對照慢病毒（CON063，NC）10 μL，polybrene 1 μL，Enhanced infection solution 2 mL。miR-21-up慢病毒及陰性對照慢病毒載體感染U2OS細胞12 h后，更換為正常含10%血清的DMEM/High-glucose培養基繼續培養72 h后熒光顯微鏡檢測細胞感染情況（綠色熒光蛋白GFP表達情況）。

1.2.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測miR-21的表達：收集感染前后各組細胞，分別加入1 mL Trizol。按照Trizol使用說明書提取細胞總RNA。反轉錄得到cDNA，反應總體積20 μL，RNA模板量1 μg。選取U6 snRNA作為內參，采用探針法定量PCR反應：反應體積20.0 μL，向0.2 mL PCR管內加入cDNA 2.0 μL、2×Real-time PCR Master Mix 10 μL、miR-21 Primer set 0.4 μL（U6 snRNA Primer set 0.4 μL）、miR-21 Probe 0.2 μL（U6 snRNA Probe 0.2 μL）、Taq DNA polymerase 0.2 μL、Sterilized H2O27.2 μL。擴增條件：95 ℃預變性3 min，然后95 ℃/12 s、62 ℃/40 s進行40個循環。每個樣品設置3個復孔。計算miR-21相對于U6 snRNA的表達比率，基因引物見表1。

表1 qRT-PCR反應引物序列

1.2.4 Transwell檢測細胞侵襲能力：Transwell小室（孔徑8 μm）微孔膜上表面預先均勾涂抹Matrigel人工基底膜20 μL，37 ℃孵箱孵育30 min使基底膜凝固。收集各組細胞，無血清培養基重懸并計數，以25×104/mL密度將細胞鋪至小室上室，下室加入含10%血清的完全培養基，培養24 h。培養結束后取出小室，以棉簽輕輕拭去微孔膜上層細胞，對微孔膜下細胞染色：PBS浸泡清洗3遍，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，PBS浸泡清洗至紫色消失，顯微鏡下觀察微孔膜并隨機計數5個非重復視野下細胞數，取均值。每組設定3個復孔。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達：收集各組細胞，細胞裂解液4 ℃裂解，12 000 r/min離心，取上清蛋白液。BCA法蛋白液濃度測定，10% SDS-PAGE電泳分離總蛋白，電泳結束后取出分離膠，通過轉膜轉移到PVDF膜。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉封閉2 h，后加入兔抗大鼠PTEN（1:1 000）、MMP-2/9（1:500）、GAPDH（1:2 000）抗體，4 ℃搖床封閉過夜。TBST洗3次，HRP標記的抗兔二抗（1:5 000）室溫搖床孵育2 h。TBST洗3次，ECL顯色，凝膠成像系統掃描并分析結果。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析。數據以±s表示，應用Graph Pad Prism 6作圖軟件作圖，2組間的比較采用獨立樣本t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-21在U2OS細胞中的表達 采用qRT-PCR檢測細胞中miR-21的mRNA表達水平，結果發現hFOB 1.19、U2OS細胞中miR-21的相對表達量分別為1.00± 0.00、5.80±0.44。與hFOB 1.19細胞相比，U2OS細胞中miR-21的mRNA表達顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 miR-21-up慢病毒感染U2OS細胞 通過參照吉凱基因公司提供的《慢病毒使用操作手冊Version 2.0》，miR-21-up及NC感染U2OS細胞（MOI=20），感染96 h后倒置顯微鏡下觀察細胞形態。與正常U2OS細胞比較，未見病毒對感染后細胞生長狀態有明顯影響。倒置熒光顯微鏡下觀察，可見絕大多數細胞成功表達GFP（表達率超過80%），見圖1，結果表明，miR-21-up慢病毒成功感染了U2OS細胞。

圖1 miR-21-up慢病毒感染U2OS細胞（×100）

2.3 qRT-PCR檢測感染前后細胞miR-21的表達情況

通過qRT-PCR檢測慢病毒感染前后各組細胞miR-21的表達情況。實驗結果顯示，與正常組和陰性對照組比，miR-21-up組miR-21的表達均上調，差異有統計學意義（P＜0.05），陰性對照組與正常組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 miR-21-up慢病毒感染前后miR-21相對表達量

2.4 miR-21對U2OS細胞體外侵襲的影響 采用Transwell檢測miR-21對U2OS體外侵襲的影響，結果顯示，正常組、陰性對照組、miR-21-up組發生侵襲的U2OS細胞數量分別為54.3±6.0、49.7±7.5、103.7±7.1。miR-21-up組細胞的侵襲能力較正常組、陰性對照組均明顯升高（P＜0.05），而陰性對照組與正常組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

2.5 miR-21靶基因預測以及Western blot檢測 通過生物信息學軟件分析，我們發現PTEN可能是miR-21的一個靶基因[9]。通過Western blot檢測發現PTEN在U2OS細胞中的表達較hFOB 1.19細胞明顯降低（P＜0.05），見圖4A。通過Western blot檢測比較慢病毒感染前后各組細胞PTEN表達情況，結果顯示，miR-21-up組PTEN的表達量較正常組、陰性對照組均明顯降低（P＜0.05），而陰性對照組與正常組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4B。

2.6 miR-21對U2OS細胞MMP-2、MMP-9表達的影響采用Western blot檢測慢病毒感染前后各組細胞MMP-2、MMP-9蛋白的表達情況，結果顯示，miR-21-up組MMP-2、MMP-9蛋白的表達量較正常組、陰性對照組均明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05），陰性對照組與正常組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖5。

圖3 Transwell檢測各組細胞侵襲能力變化（×200）

圖4 Western blot檢測各組細胞PTEN表達變化

3 討論

骨肉瘤惡性程度高，預后差，即使采用手術聯合化療，治療效果仍不佳?；蛩降闹委熞恢笔枪侨饬鲅芯恐械臒狳c，尋求有效的治療靶點是研究的關鍵。miRNA是近年來新發現的一類非編碼單鏈小RNA分子，因其表達具有時序性、時間和組織特異性以及保守性等特點，在腫瘤發生發展過程中可作為癌基因或者抑癌基因調控腫瘤轉移基因的表達[10]。研究報道miRNA與腫瘤的侵襲、轉移等生物學效應相關[11-12]。由于miR-21在絕大多數腫瘤中的表達均顯著增加，且與腫瘤的預后密切相關，因而成為近年來miRNA領域的研究熱點。YANG等[13]報道miR-21通過下調PTEN表達促進人大腸癌細胞的增殖；BAO等[14]研究表明miR-21通過抑制PTEN和hSulf-1的表達，激活AKT/ERK通路，促進肝細胞癌的進展；ZHANG等[15]報道miR-21通過下調PTEN表達而促進胃癌細胞的增殖和侵襲。但目前關于miR-21是否參與調控骨肉瘤細胞的侵襲轉移及其具體分子機制的報道很少。ZIYAN等[16]報道在骨肉瘤組織中miR-21的表達與腫瘤抑制基因RECK的表達呈負相關。VANAS等[17]研究表明miR-21可通過抑制Sprouty2的表達，進而提高骨肉瘤細胞對卡鉑治療的敏感性。因此，我們推測miR-21在骨肉瘤中同樣呈現高表達，并與骨肉瘤的發生、進展等密切相關。

圖5 Western blot檢測各組細胞MMP-2、MMP-9表達變化

我們前期的研究通過比較miR-21在人骨肉瘤細胞系（MG63、U2OS、143B、SaO2）與正常人成骨細胞系（hFOB1.19）的表達差異，發現miR-21在U2OS細胞中的表達量最高，而在MG63細胞中的表達量最低（數據未提供），研究結果與VANAS等[17]研究相一致。因此，我們選擇miR-21表達差異最大的2組細胞系（MG63、U2OS）進行后續研究。我們已經證實miR-21在骨肉瘤細胞系MG63中的作用[9]。qRT-PCR檢測結果表明miR-21在U2OS細胞的表達較hFOB 1.19細胞明顯增加。為探討miR-21對U2OS細胞侵襲的影響，本研究成功構建miR-21-up慢病毒載體，并成功感染U2OS細胞，經qRT-PCR檢測證實感染后的U2OS細胞中miR-21的表達明顯上調。本研究采用Transwell侵襲實驗推測miR-21在U2OS細胞侵襲中的作用，發現miR-21可顯著地提高U2OS細胞的侵襲能力。

PTEN是迄今為止發現的第一個具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，是繼p53基因后另一個較為廣泛地與腫瘤發生密切關系的基因[18]。PTEN蛋白在細胞生長、凋亡、遷移、侵襲等方面具有重要作用[19]。研究表明，PTEN作為抑癌基因，通過調控細胞侵襲相關蛋白的表達抑制腫瘤細胞的侵襲[20]。近些年來，關于PTEN在骨肉瘤進展中的作用研究逐漸增多[21]。LEVINE等[22]報道PTEN在狗骨肉瘤細胞中表達降低；TIAN等[23]報道miR-23a可以通過抑制PTEN的表達促進人骨肉瘤細胞遷移和侵襲。本研究通過Western blot檢測發現PTEN蛋白在人骨肉瘤細胞系U2OS中的表達較正常人成骨細胞系hFOB 1.19明顯降低，并且PTEN蛋白的表達與細胞內miR-21的表達呈負相關。研究結果表明，miR-21在U2OS細胞中能顯著地負調控PTEN的表達，推斷miR-21可通過抑制PTEN的表達促進U2OS細胞侵襲。

MMPs是一類以Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子的蛋白酶類，其主要功能是降解細胞外基質，維持細胞外基質的動態平衡[24]。腫瘤細胞能通過分泌MMPs，穿透細胞外基質基底膜形成侵襲轉移。因而，MMPs與腫瘤的侵襲轉移和預后密切相關[25]。MMP-2和MMP-9是MMP家族中參與體內細胞外基質降解的最主要的兩個蛋白，兩者能有效地分解基底膜的主要成分IV型膠原纖維和層黏連蛋白，在細胞侵襲、遷移等生物學過程中起到了更多的特殊作用。近年來的研究發現在多種腫瘤細胞中MMPs的分泌與PTEN表達呈負相關。LI等[26]研究表明PPAR-gamma可激活PTEN的表達從而抑制MMP-2的分泌，抑制胰腺癌細胞浸潤轉移；CHEN等[27]研究發現PTEN可以通過抑制MMP-9的表達而抑制肝細胞的侵襲轉移。本研究通過Western blot檢測發現MMP-2、MMP-9蛋白的表達與細胞內miR-21的表達呈正相關；同時，與細胞內PTEN的表達呈負相關。因此，我們認為miR-21可通過抑制PTEN的表達，促進MMP-2、MMP-9的表達，提高U2OS細胞的侵襲能力。

綜上所述，本研究證實miR-21可通過靶向調控PTEN基因的表達，進而促進侵襲相關蛋白MMPs的分泌，促進骨肉瘤細胞U2OS的侵襲，這為早期治療骨肉瘤侵襲轉移等提供新的思路。我們相信隨著基因技術的發展，miR-21可作為評估骨肉瘤惡性程度、有無遠處轉移等生物學行為的重要分子生物標志，不僅可以為腫瘤的早期發現及預后提供預測，并且可以作為新的靶向藥物應用于臨床中。但本研究亦存在不足之處，即體內微環境在惡性腫瘤的侵襲轉移中起著非常重要的作用，后期研究需要通過更多的體內實驗證實miR-21在骨肉瘤早期侵襲轉移中的作用。

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（本文編輯：趙翠翠）

Role and mechanism of miR-21 in human osteosarcoma cell line U2OS invasion in vitro

LYU Chen, CHEN Xin, ZHU Xiongbai, LIN Wenjun, WANG Lu, HUANG Zhengxiang, YANG Shengwu.

Department of Orthopedics, the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To study the role and mechanism of miR-21 on regulating invasion in osteosarcoma cell line U2OS in vitro.Methods:The cultivation of human fetal osteoblastic cell line hFOB1.19 and human osteosarcoma cell line U2OS. qRT-PCR was used to detect the expression of miR-21 in the previous two groups. miR-21-up lentivirus infected U2OS cells. qRT-PCR was then used to detect the expression of miR-21 between the miR-21-up-infected U2OS cells and no-infected U2OS cells. Transwell chamber invasion assay was used to observe the effect of miR-21 in U2OS cells invasion. Western blot analysis was used to verify miR-21’s role in regulating the expression of PTEN and invasive associated protein MMP-2/MMP-9 in U2OS cells.Results:qRTPCR results showed that the expression of miR-21 was signifi cantly increased in U2OS cells (P＜0.05). Transwell assay results showed that overexpression of miR-21 could signifi cantly promote U2OS cells invasion (P＜0.05). Western blot analysis results showed that the expression of PTEN was decreased in U2OS cells and negative correlated with miR-21 (P＜0.05). Western blot results analysis also showed that miR-21 could signifi cantly improve the expression of MMP-2/9 (P＜0.05).Conclusion:miR-21, which targets PTEN, promotes U2OS invasion by activating the expression of MMP-2/9.

miR-21; osteosarcoma; PTEN; matrix metalloproteinases; invasion

R730.54

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.07.005

2016-09-14

浙江省自然科學基金資助項目（LY14H060007）。

呂晨（1989-），男，江蘇鹽城人，住院醫師，博士。

楊勝武，主任醫師，碩士生導師，Email：yangshengwu188@sina.com。