腸三葉因子通過自噬在急性移植物抗宿主病中發揮保護作用

陳慧瑤，張偉，方芳，何穎，莊強，江松福

（溫州醫科大學附屬第一醫院 血液內科，浙江 溫州 325015）

·論 著·

腸三葉因子通過自噬在急性移植物抗宿主病中發揮保護作用

陳慧瑤，張偉，方芳，何穎，莊強，江松福

（溫州醫科大學附屬第一醫院 血液內科，浙江 溫州 325015）

目的：觀察腸三葉因子（ITF）在急性移植物抗宿主疾病（aGVHD）中的保護作用及其機制。方法：建立C57BL/6（H-2b）小鼠至BALB/C（H-2d）小鼠的異基因骨髓移植（allo-BMT）模型，誘導aGVHD，根據處理方式不同，分成4組。空白對照組未接受任何處理；BM組僅接受骨髓細胞移植；aGVHD組同時接受骨髓細胞和脾臟細胞移植；ITF組預防性使用ITF治療，其余處理同aGVHD組。觀察比較各組小鼠aGVHD臨床評分、生存時間、移植后外周血白細胞情況與自噬蛋白LC3在小腸黏膜上皮細胞內的表達。結果：成功建立并誘導aGVHD模型。與ITF組相比，aGVHD組小鼠提早出現典型的aGVHD臨床癥狀，生存期顯著縮短，移植后外周血白細胞最低值更低，上升緩慢，aGVHD臨床評分增加（均P＜0.05）。小腸組織免疫組織化學染色結果顯示，相較于BM組和ITF組，aGVHD組LC3表達水平明顯增加（P＜0.05）。結論：ITF對aGVHD有保護作用，可能與ITF通過降低自噬水平改善aGVHD癥狀有關。

急性移植物抗宿主病；腸三葉因子；自噬；異基因骨髓移植；小鼠

急性移植物抗宿主病（acute graft versus host disease，aGVHD）發病機制尚未完全明確。目前認為它是多層面多步驟的病理反應，首先放化療等預處理引起“細胞因子風暴”導致前炎癥因子釋放，炎癥環境促進受體抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）活化供者的T細胞，最終導致供體T細胞進入并攻擊aGVHD患者靶器官[1]。移植前的預處理導致胃腸道上皮屏障的破壞和炎癥因子的大量釋放[2]，所以腸道aGVHD不僅發生率高，而且在GVHD系統性損傷的級聯放大過程中起著重要作用。本課題組前期研究發現腸三葉因子（intestinaltrefoil factor，ITF）可以通過修復腸道黏膜，在一定程度上預防aGVHD的發生[3]，但ITF對aGVHD的保護機制仍不明確。研究[4-5]證明自噬在維護腸道黏膜的穩定性和調節aGVHD上發揮重要作用。本研究進一步觀察ITF對aGVHD中的保護作用，并探討ITF預防aGVHD作用與自噬的關系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：供鼠：C57BL/6（H-2b）小鼠，黑色，雄性，6～8周齡。受鼠：BALB/C（H-2d）小鼠，白色，雌性，6～8周齡。由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物生產許可證號：SCXK（滬）2012-0002。小鼠均飼養于溫州醫學大學實驗動物中心層流架內，每籠4～6只，溫度25 ℃，濕度70%，晝夜照明時間12 h/12 h，墊料、飼料、飲用水均經高壓滅菌處理。受鼠在移植前5 d開始飲用含慶大霉素（320 mg/L）的消毒飲用水，進行腸道凈化，直至移植后2周。

1.1.2 主要試劑：臺盼藍購自上海西唐生物科技有限公司，紅細胞裂解液購自上海碧云天公司，PBS購自美國Gibco公司，蘇木精和伊紅購自福建邁新生物技術有限公司，Anti-Mouse MHC I（H-2kb）IFTC和Anti-Mouse MHC I（H-2kd）PE購自奧地利eBiosci-ence公司，基因重組人小腸三葉因子（rh-ITF）購自北京大學蛋白質工程重點實驗室，anti-LC3購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組：將周齡相同的小鼠隨機分成空白對照組、BM組、aGVHD組和ITF組，空白對照組3只小鼠，其余各組22只小鼠。空白對照組未接受任何處理；BM組僅接受骨髓細胞移植，無脾臟細胞移植；aGVHD組同時接受骨髓細胞和脾臟細胞的移植；ITF組從移植前1 d開始預防性使用ITF 0.1 mL/d（0.1 mg/mL，溶解在0.9%氯化鈉溶液中）灌胃治療，其余處理同aGVHD組。除空白對照組外，每組小鼠取12只，分別在第1、第2、第3、第4周的末期處死3只小鼠，取小鼠腸道做免疫組織化學染色。另取每組（空白對照組除外）10只小鼠，觀察生存狀況，外周血白細胞變化，脫毛、活動度、體質量等臨床評分。

1.2.2 受鼠預處理：移植當天將小鼠裝入經高壓滅菌四周有小孔的2×5格子自制的木盒子里，盡量保證無菌環境。移植當天（即第0天）小鼠接受直線加速器全身照射（total body irradiation，TBI），照射劑量8 Gy，照射距離50 cm，照射時間8 min，劑量率1 Gy/min。

1.2.3 供鼠骨髓細胞和脾細胞制備：取出供鼠的股骨、脛骨和脾臟制成單細胞懸液。經紅細胞裂解后，用PBS洗滌2次，最后重懸成1×108/mL的單細胞懸液備用。將骨髓細胞和脾細胞1:1混合。

1.2.4 造血干細胞移植：每只小鼠尾靜脈輸注100 μL細胞，總量為1×107個細胞（其中脾臟細胞和骨髓細胞各5×106個）。

1.2.5 移植效果判定標準：①移植失敗：照射后小鼠很快就死亡，存活時間＜48 h，死亡時外周血白細胞數＜0.5×109/L。②造血衰竭：移植后白細胞數沒有復升，死亡時白細胞數＜0.5×109/L。③aGVHD發生：白細胞數＞0.5×109/L，小鼠出現納差，精神萎靡，活動度下降，嗜睡，皮膚潰瘍、脫皮，血便、腹瀉，體質量減輕，弓背，翹毛等癥狀。HE染色可觀察到肝、脾、皮膚、小腸等靶器官內有淋巴細胞浸潤，正常組織結構被破壞。④移植成功：白細胞數下降后復升，且連續3 d白細胞數＞1×109/L。

1.2.6 aGVHD臨床評分標準[6]：體質量減輕（占原體質量的百分數）＜10%為0分，10%～25%為1分，＞25%為2分。體位正常為0分，不活動時弓背為1分，嚴重弓背影響活動為2分。活動情況正常為1分，輕度至中度減少為1分，刺激時才活動為2分。毛發正常為0分，輕度至中度翹毛為1分，翹毛明顯，雜亂難以梳理為2分。皮膚正常為0分，爪部和尾部皮膚脫皮為1分，皮膚裸露明顯為2分。臨床評分為5項標準評分的總和，最高分數為10分，臨床評分超過5分為重度，3～5分為中度，小于3分為輕度。

1.2.7 嵌合體檢測：尾靜脈取血，經紅細胞裂解液裂解，用FACS緩沖液洗1次，加入1:500稀釋的Anti-Mouse MHC I（H-2kb）IFTC和1:500稀釋的Anti-Mouse MHC I（H-2kd）PE 20 μL，重懸后在4 ℃或者冰上避光孵育15 min，再用FACS緩沖液洗1～2次，重懸至200 μL的FACS緩沖液中，上機讀樣。

1.2.8 免疫組織化學LC3定位定量測定：取出小鼠的脾臟、肝臟、肺和小腸，經4%多聚甲醛溶液固定。分別經75%、85%、95%、100%乙醇梯度脫水處理20～30 min；二甲苯透明30 min～1 h，待組織成透明狀放置在60 ℃恒溫箱中蠟罐里浸蠟20～30 min，然后包埋，切片，脫蠟，梯度水化，用PBS清洗2～3次，直至載玻片周圍無蠟。此后，用0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液修復抗原，PBS清洗2～3次，用5%小牛血清在37 ℃下封閉30 min，用稀釋1:100的anti-LC3孵育液4 ℃孵育過夜，第2天經PBS清洗后，DAB顯色，再用蘇木精染色，脫水，透明，封片，鏡檢。用免疫組織化學評分（immunohistochemical score，IHS）來計算LC3蛋白的表達水平。A表示陽性細胞評分，無被染色的陽性細胞記為0，1%～10%陽性細胞記為1，10%～50%陽性細胞記為2，50%～80%陽性細胞記為3，80%～100%陽性細胞記為4。B為陽性細胞染色強度，0為陰性，1為弱陽性，2為陽性，3為強陽性。IHS=A×B[7]。

1.3 統計學處理方法 應用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料用±s表示，多組計量數據先進行正態性及方差齊性檢驗，滿足條件的計量資料再進行獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 嵌合體鑒定 移植后第21天，取小鼠尾靜脈血10 μL，經Anti-Mouse MHC I（H-2kb）IFTC和Anti-Mouse MHC I（H-2kd）IFTC染色，用流式細胞儀檢測分析受鼠中供鼠細胞的植入情況。空白對照組小鼠的外周血流式細胞儀僅顯示自身組織相容性抗原H-2kd（見圖1A），表明未接受任何移植的原始狀態；移植后小鼠均顯示供鼠組織相容性抗原H-2kb大于95%以上（見圖1B），表明骨髓移植成功。

圖1 流式細胞術嵌合體檢測結果

2.2 生存曲線 BM組小鼠第1例死亡時間是移植后第9天，中位生存期超過31 d，aGVHD組小鼠第1例死亡時間是移植后第6天，中位生存時間為17.6 d，ITF組小鼠第1例死亡時間是移植后第9天，中位生存時間為28 d。ITF組與aGVHD組比較，其第1例死亡時間和中位生存時間都明顯延后。見圖2。

圖2 移植后各組小鼠生存曲線

2.3 移植后外周血白細胞變化 未移植前小鼠的外周血白細胞數為7～10×109/L（見圖3），移植后小鼠白細胞數迅速降低，于移植后第6天降到最低，BM組、aGVHD組、ITF組小鼠的白細胞數分別為（1.62± 0.35）×109/L、 （0.88±0.23）×109/L、 （1.14± 0.30）×109/L，第6天之后BM組小鼠白細胞數迅速上升，并于第20天左右升至正常，觀察結束時間第30天時白細胞數上升至（9.27±0.63）×109/L，aGVHD組小鼠白細胞緩慢上升，在第25天全部死亡，此時白細胞數為（5.70±0.42）×109/L，ITF組小鼠白細胞數中等程度持續增加，在第25天左右恢復正常，第30天時為（7.80±0.40）×109/L。

2.4 臨床評分 臨床評分評估移植后小鼠aGVHD的嚴重情況，主要與體質量減輕、體位、毛發和活動度相關。除BM組在第7天達到最高值，其余各組小鼠的臨床評分均在第14天左右達到最高值，而后呈緩慢下降趨勢（見圖4）。BM組在第7天臨床評分為1.8±0.4，aGVHD組小鼠同時期的臨床評分為3.9± 0.3，較BM組顯著增高（P＜0.01），表明骨髓移植模型建立成功，小鼠成功出現aGVHD癥狀。第14天，ITF組與aGVHD組比較，臨床評分明顯降低（4.3±0.4 vs. 5.9±0.4，P＜0.05），表明aGVHD臨床表現緩解。2.5 自噬蛋白LC3蛋白免疫組織化學檢測結果 同一時間不同組別進行比較，在第1、第2、第3、第4周，aGVHD組的LC3水平較BM組明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。第1、第2、第3周，ITF組與aGVHD組比較，LC3表達水平下降，差異有統計學意義（均P＜0.05）。不同時間段同一組內小鼠LC3表達比較，BM組在第1周末達到高峰，而aGVHD組和ITF組均在第2周末達到高峰，隨后逐漸降低。見圖5、表1。

圖3 移植后各組小鼠外周血白細胞計數

圖4 移植后各組小鼠臨床評分

圖5 LC3在各組小鼠腸上皮的表達水平（×400）

表1 LC3的IHS在各時間點表達量的變化（n=3，±s）

表1 LC3的IHS在各時間點表達量的變化（n=3，±s）

與aGVHD組比：aP＜0.05，bP＜0.01

組別第1周第2周第3周第4周BM組159.60± 8.02b123.00± 6.00b105.00± 7.00b77.67±15.50aaGVHD組207.67± 7.02227.33±19.00176.67± 8.50117.33± 3.51 ITF組174.33±13.31a192.00± 9.00a147.33±11.10a106.33± 6.66

3 討論

腸道損傷導致腸道黏膜完整性破壞，通透性增強，內毒素和病原體遷徙易位，引起全身性炎癥反應，因此，預防和緩解移植后腸道炎癥是改善GVHD預后的一個可行方案。近年來，ITF備受關注，它在受損的腸道黏膜治愈和修復方面起重要作用[8]。正常情況下，ITF主要由腸道杯狀細胞、黏膜細胞、腺細胞分泌，通過抗凋亡、遷徙[9]、與黏蛋白相互作用形成腸道表面保護膜而發揮作用。本課題組前期研究證明，ITF可以通過促進腸道細胞遷移、抗凋亡等保護作用修復甲氨蝶呤對腸道黏膜的損傷[10]，還可以通過促進腸道受損黏膜的修復，保護腸道黏膜的完整性，從而對aGVHD起保護作用[3]。本研究通過建立aGVHD模型，預防性使用ITF灌胃治療，觀察到ITF組小鼠與aGVHD組小鼠比較，臨床評分降低，移植后白細胞下降而后復升趨勢變快，生存期明顯延長，與前期研究結果一致。

研究發現腸道炎癥反應與自噬有關。自噬是一種進化學上較為保守的細胞自我降解機制，胞質內的物質被轉移雙層膜結構的自噬溶酶體中，并被其中的溶解酶降解[11]。被細菌侵襲的腸道上皮細胞中自噬水平增高[5]。參與aGVHD早期“細胞因子風暴”的前炎癥因子可以提高自噬水平[12]。自噬可以啟動APC并激活供體T細胞，這是發生aGVHD的必要條件，而缺乏自噬基因的APC表現出處理、提呈抗原能力受損[13]和成熟障礙[14]。此外，缺乏Atg7、Atg3、Atg5的T模型中觀察到T細胞更多的凋亡和更低的生存率[15]。以上研究結果說明，抑制自噬可以降低APC啟動和增加效應T細胞的死亡，從而緩解全身性aGVHD癥狀。

溶酶體內LC3是反應自噬活動的標記蛋白，與自噬水平正相關[16]。因此本研究用LC3作為自噬水平的標記物，用免疫組織化學法對不同時期腸道內自噬水平進行定位定量的監測。結果發現，在小鼠移植模型中，各組小鼠LC3表達水平均增高，BM組在移植后第1周末達到自噬頂峰，而aGVHD組和ITF組在第2周末達到頂峰。這表明這3組小鼠在移植后由于預處理過程中放療對腸道造成損傷，腸道上皮黏膜細胞受損，炎癥因子釋放，自噬水平增加。aGVHD組和ITF組自噬水平較BM組增加明顯，且最高峰延遲，這可能是由于前2組比后組中增加了半相合的T細胞，外源性的T細胞攻擊靶器官，從而引起自噬表達更持久，表達水平增加。ITF組較aGVHD組的小鼠LC3表達水平降低，aGVHD的全身癥狀得到緩解，這可能是由于ITF保護了腸道黏膜細胞，維護了腸道的屏障功能，降低炎癥因子的釋放，從而抑制腸道上皮細胞內的自噬，自噬水平的降低則抑制aGVHD中APC的提呈作用和效應T細胞的活動，從而緩解T細胞攻擊靶器官的程度。

綜上所述，ITF可能通過減少細胞因子分泌來降低自噬水平，從而降低aGVHD的APC以及T細胞的激活，緩解aGVHD癥狀。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Intestinal trefoil factor plays a protective role in acute graft versus host disease through aotophagy

CHEN Huiyao, ZHANG Wei, FANG Fang, HE Ying, ZHUANG Qiang, JIANG Songfu.

Department of Hematology, the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To observe the protection of ITF in acute graft versus host disease (aGVHD) models, and to investigate the role of autophagy in the protective effect of ITF in aGVHD.Methods:aGVHD model was established from donor mice C57BL/6 (H-2b) to host mice BALB/C (H-2d). According to different treatment, mice were divided into 4 groups. No any treatment in control group, BM group only reveiced bone marrow transplantation, while aGVHD group

a combination of bone marrow and spleen cells, ITF group accepted prophylaxis ITF treatment on basis of aGVHD group treatment. The aGVHD level was evaluated by clinical scores, survival time, peripheral leukocyte counts and expression of LC3 by immunohistochemical staining.Results:The model of aGVHD was successfully established. Compared with ITF group, aGVHD group performanced earlier aGVHD symptoms, shorter survial time, lower peripheral WBC counts and higher aGVHD clinical scores (P＜0.05). Immunohistochemical staining (IHC) showed that aGVHD group had higher expression of LC3 compared with BM group and ITF group (P＜0.05).Conclusion:ITF play a protective role in aGVHD, which is associated with decrease of autophagy.

acute graft versus host disease; intestinal trefoil factor; autophagy; allogenic bone marrow transplantation; mice

R551.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.07.003

2017-03-16

浙江省自然科學基金資助項目（LY16H080006）。

陳慧瑤（1989-），女，浙江溫州人，碩士。

江松福，副主任醫師，副教授，碩士生導師，Email：jiangsongfu@189.cn。