Maresin-1通過ALX/NF-κB通路促進巨噬細胞的自噬

林靜，羅凌春，曹兵兵，金勝威，高昉

（溫州醫科大學附屬第二醫院 麻醉科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

Maresin-1通過ALX/NF-κB通路促進巨噬細胞的自噬

林靜，羅凌春，曹兵兵，金勝威，高昉

（溫州醫科大學附屬第二醫院 麻醉科，浙江 溫州 325027）

目的：探討促炎癥消退介質maresin-1（MaR1）對巨噬細胞自噬的影響及其機制。方法：培養小鼠骨髓來源巨噬細胞，給予MaR1后，用激光掃描共聚焦顯微鏡技術觀察LC3B聚集，用Western blot法測定LC3B與LC3A比值，用qPCR法測定ATG5、ATG7、BECN-1基因表達。用溶酶體抑制劑氯喹（CQ）、PI3K抑制劑（LY294002）、雷帕霉素、ALX抑制劑Boc-2分別預處理細胞后，測定beclin-1表達和LC3B與LC3A比值的變化。取p50-/-和WT小鼠，提取骨髓巨噬細胞，給予MaR1刺激，測定LC3B與LC3A比值的變化，及p50、p65的表達。結果：流式細胞儀測定結果顯示F4/80和CD16的共表達達90%以上。巨噬細胞經MaR1作用后，LC3B的熒光強度明顯增強，LC3B與LC3A的比值上升（P＜0.05），ATG5、ATG7、BECN-1基因表達量增高（P＜0.01）。經CQ或雷帕霉素預處理后，MaR1仍舊使巨噬細胞自噬增強。而加入LY294002預處理后，MaR1促進自噬的作用消失。經MaR1作用，巨噬細胞的p50表達量增多（P＜0.01），且在p50-/-小鼠提取的巨噬細胞上，MaR1促進自噬的作用消失。結論：MaR1通過ALX/NF-κB通路促進骨髓來源的巨噬細胞的自噬。

自噬；maresin-1；NF-κB；巨噬細胞；mTOR

自噬為真核生物細胞特有的一種代謝方式，是一種特殊的胞內吞噬現象[1]。組織細胞通過自噬作用來降解細胞內的受損細胞器、折疊錯誤的蛋白質和核酸等內容物，并重新利用氨基酸、核糖等代謝物，從而維持細胞穩態，因此正常情況下，自噬是一個積極地自我更新過程[2-3]。炎癥消退是一個主動的過程，在炎癥開始幾個小時后，一系列促消退介質產生，抑制白細胞的滲出，中性粒細胞的聚集，啟動細胞凋亡，促進巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬，從而使內環境恢復至穩態[4-7]。Maresin-1（MaR1）是其中一種主要由巨噬細胞分泌的以二十二碳六烯酸（DHA）為來源產生的新型抗炎促消退介質[8-10]，能促進巨噬細胞的轉型及吞噬功能，有助于維持巨噬細胞內穩態。已有研究表明炎癥消退介質脂氧素、消退素能促進巨噬細胞的自噬[3]，然而MaR1對巨噬細胞自噬的影響尚不清楚，因此本研究主要探索MaR1對巨噬細胞自噬的影響及其具體機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗對象：雄性C57BL/6小鼠，6～10周齡，體質量為23～25 g，購自上海斯萊克實驗動物公司，雄性p50-/-小鼠，6～10周齡，體質量為23～25 g，購于美國杰克遜實驗室，所有動物均飼養于溫州醫科大學實驗動物中心，動物許可證編號為SYXK（浙）2013-041。小鼠來源L929細胞株購于上海新舟生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑：MaR1、LY294002、雷帕霉素、氯喹（chloroquine，CQ）、LC3抗體購于美國Sigma公司，胎牛血清、DMEM高糖培養基購于美國Gibical公司，CD11b和F4/80抗體購于美國Biolegend公司，反轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒購于美國Thermo公司，p50、p65、LC3B抗體購于美國Abcam公司，Beclin-1抗體購于美國CST公司，β-actin多克隆抗體購于美國Santa Cruz公司，熒光二抗購于杭州谷歌生物公司，DAPI購于上海碧云天生物技術有限公司，Trizol購于美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓來源巨噬細胞培養：斷頸處死小鼠，游離出小鼠的股骨和脛骨。剪去兩端軟骨，用紅細胞裂解液沖下骨髓腔內的細胞，吹打均勻后離心去上清。在試管中加入含L929細胞株培養上清液DMEM培養基，接入六孔板中，放入培養箱培養。細胞放置24 h后再往六孔板加L929上清培養液2 mL，再培養3 d，換10%完全培養基，再培養3 d后即為成熟的巨噬細胞，之后每2 d換液。

1.2.2 流式細胞技術：取出已培養好的細胞，胰酶消化至EP管中，PBS清洗殘余胰酶后用多聚甲醛固定，PBS重懸后加入CD11b和F4/80避光染色，用Beckmen流式細胞儀FC500進行檢測。所有數據用CytExpert或FlowJo 7.6軟件進行處理分析。

1.2.3 Western blot：取出成熟巨噬細胞，加入裂解液，4 ℃靜置10 min后收集裂解液，于4 ℃12 000 r/min離心20 min，提取上清即為總蛋白。經電泳、轉印，5%正常小牛血清封閉，抗p50（1: 500）、抗p65（1:1 000）、抗LC3（1:1 000）、抗beclin-1（1:1 000）和抗β-actin（1:1 000）4 ℃下孵育，過夜；二抗于室溫下孵育2 h；ECL顯色，X線膠片曝光成像，經自動電泳凝膠成像分析儀采集圖像。測量30 μg總蛋白中目的蛋白特異性條帶相對表達強度（灰度值），再與內參相對表達強度進行比較，得出相對比值R并進行統計學分析。

1.2.4 激光掃描共聚焦顯微鏡技術：在培養板中將已爬好細胞的玻片用4%多聚甲醛-PBS固定液常溫固定30 min。0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫破膜20 min。正常山羊血清室溫封閉30 min；每張玻片滴加稀釋好的一抗LC3B并放入濕盒，4 ℃孵育過夜。避光滴加熒光二抗，濕盒中20～37 ℃孵育1 h。滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核。用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在激光掃描共聚焦顯微鏡（Nikon Eclipse Ti）下觀察采集圖像。

1.2.5 RT-qPCR技術：引物序列分別為GAPDH：5’-AA GAAGGTGGTGAAGCAGG-3’，5’-GAAGGTGGAAGAGTGGGAG T-3’；ATG5：5’-TGAAGATGGAGAGAAGAGGA-3’，5’-TAGCG AGGAGGACACACT-3’；ATG7：5’-AGAACCAGAAAGGAGGCA-3’，5’-CACTTGACAGACACGACCT-3’；Becn1：5’-TCCTTTC CCTCTTTCCTG-3’，5’-GTCCTTTCCCCACATCAC-3’；實驗步驟：用Trizol提取細胞RNA，用反轉錄試劑盒轉錄為cDNA后，上機檢測。反應程序：95 ℃預變性2 min進入循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ l min，40個循環；進入融解曲線階段，60 ℃ l min，95 ℃ 15 s。將PCR所得到的目的基因CT值與其對應內參CT值相減進行得到ΔCT，再與對照組的ΔCT相減得到ΔΔCT，則目的基因的量為2-ΔΔCT。

1.2.6 細胞處理和分組：取已成熟的巨噬細胞，換液后分為對照組（不做處理），MaR1組（MaR1 100 nmol/L作用1 h），CQ組（CQ 30 nmol/L處理12 h），CQ+MaR1組（CQ預處理12 h后加MaR1作用1 h），LY組（LY294002 10 nmol/L處理細胞12 h），LY+MaR1組（LY294002預處理細胞后，MaR1 100 nmol/L處理細胞1 h），Boc-2組（Boc-2 10 nmol/L處理細胞12 h），Boc-2+MaR1組（Boc-2 10 nmol/L預處理細胞12 h后，MaR1處理細胞1 h），雷帕霉素組（用雷帕霉素20 nmol/L處理細胞30 min），雷帕霉素+MaR1組（雷帕霉素20 nmol/L預處理細胞30 min后，MaR1處理細胞1 h）。取成熟的野生型巨噬細胞和p50敲除巨噬細胞分為野生對照組、敲除對照組（不做處理）、野生MaR1組和敲除MaR1組（MaR1 100 nmol/L處理細胞1 h）。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS19.0統計軟件進行統計分析。所有數據以±s表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠骨髓來源巨噬細胞純度鑒定 流式細胞術檢測細胞表面抗原CD11b和F4/80表達的結果顯示，F4/80與CD11b共表達高于90%，巨噬細胞純度達90%以上，見圖1。

圖1 流式細胞術鑒定巨噬細胞的純度

2.2 MaR1促進巨噬細胞的基礎自噬 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測LC3B表達的結果顯示，MaR1組LC3B光斑表達高于對照組，CQ+MaR1組LC3B光斑表達高于CQ組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。RT-qPCR檢測結果顯示，經MaR1作用后，ATG5、ATG7、BECN1基因表達均上調（P＜0.01），加入LY294002后，MaR1上調ATG5、ATG7基因的作用消失（P＜0.01），見圖3。Western blot檢測結果顯示，CQ+MaR1組LC3B/A比值高于CQ組（P＜0.01），見圖4。

2.3 MaR1通過ALX/NF-κB通路、非mTOR通路促進巨噬細胞的基礎自噬 LC3和beclin-1的Western blot檢測結果顯示，加入MaR1后，beclin-1的表達量增加（P＜0.05），Boc-2處理后，MaR1作用消失。加入MaR1后，LC3B/A的比值升高（P＜0.05），雷帕霉素預處理后，MaR1依舊能使LC3B/A的比值升高（P＜0.05），見圖4。p50、p65及LC3的Western blot檢測結果顯示，加了MaR1后，p50的表達量增加（P＜0.01），而p65差異無統計學意義（P＞0.05）。在野生型老鼠骨髓來源的巨噬細胞上，MaR1能使LC3B/A比值增加（P＜0.01），而在p50敲除巨噬細胞上，MaR1的作用消失。見圖5。

3 討論

本研究發現MaR1通過ALX/NF-κB通路促進骨髓來源的巨噬細胞的自噬。預實驗中，MaR1的量效實驗結果顯示MaR1在100 nmol/L的時候作用最為明顯，時效實驗結果并無明顯區別，參考PRIETO等[3]的實驗確定作用時間為1 h，因此本研究確定MaR1的作用濃度為100 nmol/L，作用時間為1 h。本研究中，激光掃描共聚焦顯微鏡的結果表明MaR1可以增加巨噬細胞LC3B光斑的表達，Western blot的結果也提示MaR1能增加巨噬細胞中beclin-1的表達和LC3B/A的比值。ATG5、ATG7是自噬相關基因，BECN-1是編碼beclin-1的基因，qPCR的結果說明，MaR1能增加ATG5、ATG7和BECN-1的基因表達。由此得出結論，MaR1能促進巨噬細胞的自噬。

為探究MaR1對自噬流的影響，我們使用了LY29 4002（PI3K抑制劑）和CQ（溶酶體抑制劑）。PI3K是自噬小體成核階段需要的復合物組成之一[11]，使用LY294002后自噬小體的形成受到阻礙，qPCR的結果顯示，使用PI3K抑制劑后MaR1促進ATG5、ATG7基因表達的作用消失，而對BECN-1基因的表達無影響。由此我們推論，當自噬小體形成受到干擾時，MaR1的作用消失，也就是MaR1是通過促進自噬小體的形成來促進自噬的。當使用CQ后，溶酶體功能被抑制，自噬小體與溶酶體結合后無法降解，所以LC3B積聚。激光掃描共聚焦顯微鏡和Western blot的結果顯示，溶酶體被抑制的情況下MaR1依舊可使LC3B增多，綜上，我們推斷MaR1能促進自噬小體形成。

接著本研究探究了MaR1促進巨噬細胞的基礎自噬機制。MaR1是近幾年新發現的炎癥消退介質，其受體未知，我們使用了脂氧素（另一種炎癥消退介質）的受體ALX的抑制劑Boc-2來研究MaR1是否通過ALX來作用于巨噬細胞。Western blot結果顯示MaR1能使beclin-1（自噬小體成核階段的復合物之一）表達升高，而用Boc-2預處理后，其作用消失，由此推斷MaR1可能是通過ALX受體對自噬起作用。

圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測LC3B熒光光斑（×400）

激活自噬的通路主要有mTOR依賴和非mTOR依賴途徑。mTOR作為自噬調控的中心分子，是控制細胞自噬的關鍵蛋白，能感受細胞的多種變化信號，加強或降低自噬的水平。細胞內ATP水平、缺氧、饑餓等細胞信號都可直接或間接通過mTOR將其整合，從而改變細胞的自噬發生，應對不同的外界環境刺激。mTOR原本處于活化狀態，磷酸化會抑制自噬起始分子ULK1，從而抑制自噬的發生[14]。除了通過mTOR激活自噬外，還有非mTOR依賴的通道能刺激自噬的產生，如IP3通路和NFE2L2等[2，13]。有研究發現，脂氧素與消退素是通過非mTOR通路促進巨噬細胞的自噬[3，15]。為了探究MaR1對自噬的作用是否通過mTOR起作用，我們用雷帕霉素預處理細胞12 h。雷帕霉素能抑制mTOR，從而刺激自噬的產生。Western blot結果顯示，用了雷帕霉素后，LC3B/A比值升高，在經雷帕霉素預處理的細胞中，加入MaR1后，MaR1依舊能使LC3B/A比值增高。由此推測MaR1對巨噬細胞的自噬作用不通過或者不全通過mTOR，即MaR1可能通過非mTOR通路促進巨噬細胞的基礎自噬。

圖3 ATG5、ATG7、BECN1基因的RT-qPCR檢測結果

圖4 Western blot檢測LC3和beclin-1的表達

圖5 Western blot檢測p50、p65、LC3的表達

在證明了MaR1可能不通過mTOR通路促進自噬后，為進一步探究MaR1促進自噬的通路，我們又研究了MaR1與NF-κB通路的關系。NF-κB是一個轉錄因子家族，包括5個亞單位：Rel（cRel）、p65（RelA）、RelB和p50、p52，NF-κB一般以二聚體的形式出現，最常見的二聚體為p65與p50組成的異二聚體或p50/ RelA，除此之外還有p65/p65、p50/p50等同二聚體。當細胞受到各種胞內外刺激后，IκB激酶被激活，水解IκB蛋白，從而使NF-κB二聚體得到釋放[12，16]，并轉移到細胞核中。在細胞核里，它與目的基因結合，以促進目的基因的轉錄。Western blot結果提示，MaR1能使巨噬細胞胞內的p50增加，而p65并無顯著變化，所以MaR1是否通過NF-κB的亞基p50來促進自噬？為了進一步求證p50和MaR1與自噬的關系，我們用p50基因敲除小鼠培養了p50-/-巨噬細胞，Western blot結果顯示，在p50-/-巨噬細胞里，MaR1無法促進巨噬細胞的自噬，由此我們可以推斷MaR1是通過NF-κB的亞基p50來促進自噬。NF-κB通路一直被認為是一條促進炎癥的主要通路[17]，之前有研究報道MaR1是抑制NF-κB通路的激活，從而抑制炎癥的發生[18]。后來又有研究發現，NF-κB不僅與炎癥的發生相關，與炎癥的消退也有重要的關系，而這主要依賴于p50/p50二聚體[16，19]，我們的研究發現MaR1通過p50促進巨噬細胞的基礎自噬，而MaR1是否通過促進p50/p50二聚體的生成[20]，從而促進自噬呢？要驗證這一點還需繼續探索。

綜上所述，MaR1能通過ALX/非mTOR/NF-κB p50通路促進小鼠骨髓來源巨噬細胞自噬小體的形成，從而促進自噬。

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（本文編輯：賈建敏）

Maresin-1 activates autophagy in macrophages via ALX/NF-κB pathway

LIN Jing, LUO Lingchun, CAO

Bingbing, JIN Shengwei, GAO Fang. Department of Anesthesiology, the Second Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To detect the activation of macrophage autophgy caused by maresin-1 (MaR1) and the possible related signaling pathway.Methods:The mice bone marrow-derived macrophages (BMDMs) was cultured in vitro. The expressin of LC3B was observed under laser scanning confocal microscope, the ratio of LC3B and LC3A was detected by Western blot, the expresion of ATG5, ATG7, BECN-1 gene were detected by qPCR after giving MaR1. Then macrophages were pretreated separately with lysosomal inhibitors (CQ), PI3K inhibitors (LY294002), mTOR inhibitors (rapamycin), ALX inhibitors (Boc-2), and the ratio of LC3B and LC3A or the expression of beclin-1 were detected.Results:Mice BMDMs were consisted of approximately 90% F4/80 expression asassessed by fl ow cytometry. The expression of LC3B was distinctly increased when given MaR1 which observed under laser scanning confocal microscope (P＜0.05), so is the ratio of LC3B and LC3A which detected by Western blot (P＜0.05), and the expression of ATG5, ATG7, BECN-1 which detected by qPCR (P＜0.01). When cells were pretreated by CQ or rapamycin, the effect of MaR1 was not diappeared, when pretreated by LY294002, the effect of MaR1 was diappeared. After treatment by MaR1, the expression of p50 was increased (P＜0.01), the effect of MaR1 in the macropages come from p50 KO mice was disappeard.Conclusion:MaR1 activates autophagy in macrophages via ALX/NF-κB pathway.

autophagy; maresin-1; NF-kappa B; macrophages; mTOR

R364

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.07.002

2017-03-01

國家自然科學基金資助項目（81571862）。

林靜（1991-），女，浙江溫州人，碩士生。

高昉，教授，博士生導師，Email：f.gaosmith@bham. ac.uk。