滴滴涕脅迫對棘跳蟲的毒理研究

劉國翠

摘要 [目的]探討有機氯類農(nóng)藥對土壤動物的毒害作用。[方法]對棘跳蟲進行不同濃度的滴滴涕（DDT）暴露脅迫，同時采用彗星實驗技術(shù)研究棘跳蟲細胞DNA的損傷程度。[結(jié)果]棘跳蟲死亡率與DDT濃度呈明顯正相關(guān)；DDT對棘跳蟲24、48、72、96 h的半數(shù)致死濃度分別為31.83、24.28、17.15和13.93 μg/L，安全質(zhì)量濃度為1.39 μg/L。不同濃度的DDT暴露均能引起棘跳蟲細胞DNA的損傷，其最大損傷程度可達3級，且彗星尾長、尾距及彗星尾部DNA含量變化與DDT濃度有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。[結(jié)論]試驗首次選取跳蟲類作為指示動物，通過在細胞水平探究有機農(nóng)藥DDT對棘跳蟲細胞DNA的損傷，為評估土壤污染物對土壤動物的毒害機制提供了新思路。

關(guān)鍵詞 棘跳蟲；滴滴涕；半數(shù)致死濃度；DNA損傷

中圖分類號 S482.3+2；X171.5 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）13-0151-03

Toxic Effects of Dichlorodiphenyltrichloroethane on the Springtails Onychiuyus fimeitayius linnaeus

LIU Guo-cui

（College of Life Sciences， Liaocheng University， Liaocheng， Shandong 252000）

Abstract [Objective] The aim was to study toxic effects of dichlorodiphenyltrichloroethane on the springtails Onychiuyus fimeitayius linnaeus. [Method] The effects of pp-dichlorodiphenyltrichloroethane （DDT） on DNA damage in the springtails of Onychiuyus fimeitayius linnaeus were studied by comet assay. Meantime， the mortality of the springtails was observed after different concentrations of DDT exposure. [Result] The DDT had significant toxic effect on the mortality of the springtails. The median lethal dose was 31.83， 24.28， 17.15， 13.93 μg/L on 24， 48， 72 and 96 h， respectively. The safe concentration was 1.39 μg/L. The DNA damage of springtails cells could be induced under the different mass concentrations of DDT， and the maximum damage degree could reach to 3 levels. The effects of DDT stress on comet tail length， tail length and DNA content in the tail of springtails cells were significantly related to the dose-effect relationship. [Conclusion] It provides a new idea to evaluate the toxicity mechanism of soil pollutants to soil animals， by using the springtails as the indicator animal.

Key words Onychiuyus fimeitayius linnaeus；Dichlorodiphenyltrichloroethane；Median lethal dose；DNA damage

棘跳蟲（Onychiuyus fimeitayius linnaeus）屬于無翅亞綱彈尾目跳蟲科的一類農(nóng)業(yè)昆蟲。由于較強的環(huán)境耐受力與繁殖力，棘跳蟲對蔬菜、食用菌等經(jīng)濟作物的危害日益嚴重，已成為制約經(jīng)濟作物健康發(fā)展的害蟲之一。

人工合成的有機氯農(nóng)藥滴滴涕（DDT）因具有極好的殺蟲效果，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲及瘧疾和斑疹傷寒等蟲媒傳染病的控制。據(jù)統(tǒng)計，我國累計使用DDT總量達46.4萬t，占世界DDT使用總量的 25.8%[1]。土壤是DDT最主要的環(huán)境介質(zhì)，人類活動產(chǎn)生的大量DDT經(jīng)過各種途徑進入土壤，通過食物鏈最終在動物體脂肪組織內(nèi)高度富集，其蓄積系數(shù)可達百萬倍。調(diào)查顯示，DDT使用量最高的是華東和華北地區(qū)，其次是華南地區(qū)和新疆棉田地區(qū)[2-3]。

有關(guān)殺蟲劑對跳蟲類的防治工作已取得一定成效。陳先玉[4]通過觀察高效氯氰菊酯、溴氰菊酯等農(nóng)藥對棘跳蟲死亡率的影響，探究了相關(guān)殺蟲劑在蔬菜種植及防治跳蟲類侵害等方面的應(yīng)用。但目前相關(guān)研究僅停留在害蟲防治的數(shù)量及暴發(fā)頻次上，相關(guān)有機殺蟲劑對跳蟲類昆蟲細胞水平的毒理研究仍然匱乏。鑒于此，筆者通過彗星電泳技術(shù)探究了不同濃度的有機氯農(nóng)藥DDT對棘跳蟲細胞DNA損傷的影響，以期從細胞水平揭示環(huán)境農(nóng)藥對跳蟲類昆蟲毒害的分子機制，為跳蟲類的防治及農(nóng)藥的劑量應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器。

電泳儀（型號為DYY-7C），購自北京六一儀器廠；熒光倒置顯微鏡（型號為IX71），購自日本Olympus公司；臺式冷凍離心機（型號為5702），購自德國Eppendorf公司；高壓蒸汽滅菌鍋（型號為YX280B），購自上海三申醫(yī)療器械有限公司；電子天平（型號為AY220），購自日本Shimadzu公司；純水儀（型號為MilliQ），購自美國Millipore公司。

1.1.2 主要試劑與藥劑。

低熔點瓊脂糖凝膠購自Biotech公司；Tris、DMSO、曲拉通X-100等均購自美國Amresco公司；臺盼蘭、SYBR Green1熒光染料等均購自美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

pp-DDT 購自美國Sigma公司；富鉻酵母購自河北燕科生物科技有限公司。

1.1.3 試驗動物。

棘跳蟲于2015年9月采自聊城大學(xué)試驗田。采用吸器挑選500只彈跳力較強的個體，體長為（1.2±0.1） mm。于恒溫箱25 ℃馴養(yǎng) 7 d，期間喂食酵母菌。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物分組與給藥。

根據(jù)國內(nèi)DDT污染狀況與預(yù)試驗設(shè)置5個濃度的DDT酵母溶液，分別為0、5、10、20、40 μg/L。以DMSO作為溶劑配制40 μg/L母液，然后分別稀釋至各濃度。試驗處理組均設(shè)置3個平行，每個平行30只棘跳蟲，容器為600 mL聚乙烯盒。試驗期間每天于固定時間喂食含不同濃度DDT的酵母溶液。

1.2.2 彗星試驗方法。

于暴毒96 h時分別采集不同DDT濃度暴露下的棘跳蟲，進行DNA損傷探究試驗。彗星電泳方法參照 Singh 等[5]的方法并略加改進，采用三明治凝膠法。制膠前用0.5%臺酚藍染色法檢測細胞活力，于4 ℃下鋪膠；待凝膠完全凝固后，將制備好的凝膠片放入新鮮配制的預(yù)冷的裂解液裂解1 h，4 ℃蒸餾水漂洗掉表層裂解液后，將載玻片移入盛有新鮮配制的預(yù)冷的電泳液（1 mmol/L Na2EDTA，300 mmol/L NaOH，pH 13）的電泳槽的陽極端解旋30 min；待雙鏈DNA解旋后于電壓25 V、電流300 mA環(huán)境下電泳30 min；電泳完畢后，用Tris-HCl浸泡膠片5 min，后經(jīng)50%、70%、90%、100%等濃度乙醇脫水，然后于4 ℃冰箱中保存凝膠玻片。7 d內(nèi)取出膠條，經(jīng)SYBR Green1染色后于熒光顯微鏡下觀察、拍攝單細胞電泳圖像用于熒光分析。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析。

分別于24、48、72、96 h在顯微鏡下觀察記錄棘跳蟲的生存及死亡情況，以玻璃棒碰觸蟲體10 s內(nèi)無肢體反應(yīng)為死亡標準。利用CASP 1.2.2軟件分析彗星圖像[6]，檢測指標包括彗星尾長（TL）、Olive 尾距（OTM）、彗星尾部DNA百分含量（Tail DNA%）。TL反映了損傷產(chǎn)生的DNA片段移動的距離；Tail DNA%=尾部 DNA 熒光強度/（頭部 DNA 熒光強度+尾部 DNA 熒光強度）×100%；OTM=尾部重心至頭部重心距離×尾部 DNA 百分比。

采用SPSS 19.0軟件進行各時間點的半數(shù)致死濃度（LC50）計算及單因素方差分析，同時采用Duncans多重比較法分析各組間的差異顯著性，結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 DDT對棘跳蟲死亡率的影響

由圖1可知，隨暴毒時間的延長，各濃度的棘跳蟲死亡率均呈上升趨勢，與空白對照組差異顯著；最大死亡率出現(xiàn)在96 h的最高濃度組。同時，相同濃度的DDT暴露組隨著時間的延長，棘跳蟲死亡率也呈持續(xù)上升的趨勢。

急性毒性試驗結(jié)果表明，DDT暴露對棘跳蟲24、48、72、96 h的LC50分別為31.83、24.28、17.15和13.93 μg/L，其安全質(zhì)量濃度為1.39 μg/L。總體而言，各時間點LC50、95%置信區(qū)間（CI）及各時間致死濃度表現(xiàn)出良好的時間-劑量效應(yīng)。隨DDT暴露時間的延長，其LC50呈現(xiàn)下降趨勢，于96 h達到最低值（表1）。

2.2 DDT對棘跳蟲DNA的損傷

由圖2可知，在熒光顯微鏡下，DNA片段被SYBR Green1核酸染料染成翠綠色。在DMSO對照組中，細胞呈圓形熒光頭部，并未發(fā)現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，表明在溶劑對照組細胞中未發(fā)生DNA鏈的斷裂（圖2-a）。隨著DDT暴露濃度的升高，棘跳蟲細胞DNA鏈斷裂情況愈加嚴重，表現(xiàn)為DNA斷片離頭部向陽極方向遷移，在激發(fā)光下呈現(xiàn)可見的慧星樣拖尾（圖2-b～e）。且濃度越高，彗星尾部拖尾越嚴重，表明隨著DDT濃度的升高，棘跳蟲細胞DNA損傷程度愈加嚴重。

由圖3可知，不同質(zhì)量濃度DDT暴露均能引起棘跳蟲細胞DNA的損傷，表現(xiàn)為彗尾DNA含量（Tail DNA%）的增加、彗尾長度（TL）加長、Olive尾矩（OTM）增加。3個指標間存在較高的相關(guān)性，說明采用以上3個指標，可以很好地反映跳蟲細胞DNA的損傷狀況。根據(jù)彗星尾部DNA百分含量，可將DNA損傷的程度分為5級[7]。以此指標，溶劑對照組Tail DNA%<5%，無損傷；5和10 μg/L濃度組Tail DNA%在5%～20%，屬于中度損傷中的1級損傷；20 μg/L濃度組Tail DNA%在20%～40%，屬于中度損傷里的2級損傷；最高濃度組（40 μg/L）Tail DNA%含量在40%～95%，屬于重度損傷里的3級損傷。

3 結(jié)論與討論

彗星電泳又稱單細胞凝膠電泳（SCGE），因其靈敏、簡便、快捷等特點，被廣泛用于檢測DNA遺傳損傷細胞凋亡、生態(tài)毒理等領(lǐng)域。目前，利用彗星電泳技術(shù)監(jiān)測海洋環(huán)境的污染狀況已被列入國際通用手段[8]，而在土壤污染物環(huán)境監(jiān)測方面的應(yīng)用鮮見相關(guān)報道。以DDT為代表的殺蟲劑類藥物在土壤中的積累會破壞土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[9]。同時，一定濃度的DDT積累可引起昆蟲乃至高等動物機能亢進和驚厥，最終導(dǎo)致死亡[10]。跳蟲作為土壤中的一類優(yōu)勢種群，不但基數(shù)大，對土壤污染物刺激也十分敏感，具有成為土壤環(huán)境質(zhì)量指示生物的潛力[11]。結(jié)合該研究可以發(fā)現(xiàn)，在DDT暴露24 h內(nèi)，棘跳蟲已對低濃度的DDT暴露（5 μg/L）產(chǎn)生反應(yīng)，同時彗星結(jié)果同樣顯示DDT低濃度組對棘跳蟲細胞DNA造成嚴重損傷。以上結(jié)果證實，跳蟲對土壤有機氯類農(nóng)藥污染物反應(yīng)靈敏，可嘗試用于土壤環(huán)境污染物的檢測評估。

受限于土壤污染評價方法，長期以來對土壤質(zhì)量評價的研究集中在檢測污染物的濃度分布狀況等方面，而很少將污染物與指示生物二者之間結(jié)合起來評價。目前國內(nèi)外關(guān)于土壤污染物毒理的研究主要集中在探究相關(guān)污染物對蚯蚓的毒理及DNA的損傷狀況，以此來評價土壤污染物對生物體的生理機制[12]。因此，從生物機制層面探究一種對土壤有機污染物毒害作用的快速有效的檢測方法，已成為當務(wù)之急。

該研究通過對棘跳蟲細胞SCGE試驗，發(fā)現(xiàn)DDT脅迫對棘跳蟲細胞的彗星尾長、尾距及彗星尾部DNA含量影響有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，且3個指標具有很好的一致性。說明不同濃度的DDT脅迫均對棘跳蟲細胞造成了不同程度的損傷，且彗星的3個指標可以很好地用于DDT毒理評價的聯(lián)合指標。說明利用跳蟲作為指示生物，通過探究土壤環(huán)境中有機污染物對跳蟲類的DNA損傷，可以快速有效地評價土壤污染生態(tài)風(fēng)險。

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