馬齒莧ISSR—PCR反應體系與反應條件的優化

王昭云 那冬晨

摘要 [目的]優化馬齒莧ISSR-PCR反應體系與反應條件。[方法]以馬齒莧為試驗材料，采用改良的CTAB法提取總DNA，對ISSR-PCR引物進行篩選，同時進行ISSR-PCR反應體系和反應條件的優化，電泳檢測ISSR-PCR產物。[結果]8個ISSR引物適合馬齒莧的ISSR-PCR分析；最適反應體系為總體系25.0 μL，其中2×Taq Platinum PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L引物2.0 μL，40 mg/L DNA模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL；最適反應條件為94 ℃預變性360 s；

94 ℃變性60 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，30次循環；72 ℃再延伸300 s。[結論]建立了馬齒莧ISSR-PCR擴增的最佳反應體系和擴增程序，為進一步研究馬齒莧提供基礎資料。

關鍵詞 馬齒莧；ISSR-PCR；反應體系；反應條件

中圖分類號 S647 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）13-0147-02

Optimization of ISSR-PCR Reaction System and Reaction Condition of Portulaca oleracea L.

WANG Zhao-yun1，NA Dong-chen1，2 *

（1.Modern College of Arts and Sciences，Shanxi Normal University， Linfen，Shanxi 041000；2.College of Life Sciences，Shanxi Normal University，Linfen，Shanxi 041000）

Abstract [Objective]To optimize ISSR-PCR reaction system and reaction condition of Portulaca oleracea L.[Method]Taking P.oleracea L.as the research object，using improved CTAB method to extract total DNA of P.oleracea L.，the ISSR-PCR primers were screened，at the same time ISSR-PCR reaction system and reaction condition were optimized to test ISSR-PCR products by electrophoresis.[Result]Eight primers were suitable for ISSR-PCRof P.oleracea L..The optimal reaction system was that total reaction system 25.0 μL，including 12.5 μL 2×Taq Platinum PCR Master Mix，2.0 μL 10 μmol/L primers，1.0 μL 40 mg/L DNA templates，9.5 μL ddH2O.The optimal reaction condition was that pre-degeneration at 94 ℃ for 360 s，going to 30 cycles：degeneration at 94 ℃ for 60 s，annealing at 54 ℃ for 60 s，extension at 72 ℃ for 90 s，then extension at 72 ℃ for 300 s after 30 cycles.[Conclusion]The optimizing ISSR-PCR reaction system and reaction condition of P.oleracea L.were established to provide basis for further study P.oleracea L..

Key words Portulaca oleracea L.；ISSR-PCR；Reaction system；Reaction condition

馬齒莧（Portulaca oleracea L.）為馬齒莧科馬齒莧屬一年生草本植物，藥食兩用[1]。全株無毛，莖紫紅色，圓柱形，平臥或斜倚，伏地鋪散，葉互生，有時近對生，葉片扁平，肥厚，倒卵形，頂端圓鈍或平截，有時微凹，基部楔形，全緣[2]。馬齒莧適應性強，適宜在溫暖、濕潤、肥沃的壤土或沙壤土中生長，耐旱亦耐澇，生于田野路邊及庭園廢墟等向陽處，國內各地均有分布。

ISSR是在簡單重復序列（SSR）基礎上發展起來的新型分子標記，由加拿大蒙特利爾大學的Zietkiewicz等[3]提出。ISSR綜合了其他分子標記高多態性、可重復性、低成本、易操作以及無需知道基因組序列等優點[4-5]，現已被廣泛應用于鑒定種質、分析遺傳關系、構建遺傳圖譜等研究[6]。該研究以馬齒莧為試驗材料，對影響ISSR-PCR反應體系的各因素進行優化，建立馬齒莧ISSR-PCR擴增的最佳反應體系和擴增程序，為進一步研究馬齒莧提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。

馬齒莧，采于山西省臨汾市汾河公園，該地處于半干旱、半濕潤的氣候區，屬暖溫帶大陸型氣候，冬寒夏熱，四季分明，雨熱同期。……