膠東地區金銀花品種間遺傳關系的RAPD分析

王一斐 劉林德 葛宜和 孫太元

摘要 [目的]探討不同金銀花（Lonicera japonica）品種間的遺傳關系。[方法]利用RAPD分子標記技術對膠東地區31個金銀花品種的遺傳多樣性及遺傳關系進行研究。[結果]5個引物共擴增出650條帶，每個引物可擴增出0～9個條帶。聚類分析結果表明，31個金銀花品種可以分為兩大類，采自昆崳山太白頂的金銀花品種為一類，其余30個金銀花品種為一類。從遺傳距離來看，采自昆崳山太白頂的品種與中醫世家引進金銀花品種大毛花遺傳距離最遠，為2.507；采自龍口蘭高鎮馬藺塂（Ⅱ）與中醫世家引進金銀花品種四季豐遺傳距離最近，為0.020。[結論]不同金銀花種源間具有較高的遺傳多樣性，不同金銀花種源間的遺傳關系與地理分布有一定的相關性。

關鍵詞 金銀花；聚類分析；遺傳多樣性；RAPD；膠東地區

中圖分類號 S567.7+9 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）13-0145-02

RADP Analysis of Genetic Relationships Among Cultivars of Lonicera japonica in Jiaodong Region

WANG Yi-fei1 ， LIU Lin-de1*， GE Yi-he1 et al

（1.College of Life Sciences，Ludong University，Yantai，Shandong 264100）

Abstract [Objective]Genetic relationships among cultivars of Lonicera japonica were studied.[Method]Genetic diversity and genetic relationship of 31 varieties of L. japonica in Jiaodong Region were studied by using Random Amplified Polymorphic DNA （RAPD） molecular marker technology. [Result]5 primers were used to amplify 650 bands. Each primer could amplify 0-9 bands. The result of cluster analysis showed 31 kinds of L. japonica varieties could be divided into two categories， one was from Taibai Top of Kunyu mountain， the other was anther category. From the genetic distance， the variety from Taibai Top of Kunyu mountain and the Damao flower which was introduced by family of traditional Chinese Medicine had the farthest genetic distance， it was 2.507.The variety from the Malin Port of Longkou Langao town and the Sijifeng flower which was introduced by family of traditional Chinese Medicine had the nearest genetic distance， it was 0.020. [Conclusion]There was high genetic diversity among different cultivars of L. japonica，the genetic relationship among different cultivars of L. japonica had a certain correlation with geographical distribution.

Key words Lonicera japonica；Cluster analysis；Genetic diversity；RAPD；Jiaodong region

金銀花（Lonicera japonica）為忍冬科忍冬屬多年生半常綠藤本植物[1]。全世界忍冬屬植物約200種，我國有98種[2]。金銀花具有清熱解毒、消炎退腫、保肝抗病毒、延緩衰老的功效，研究發現它還具有良好的抗癌、抗艾滋病的作用，屬衛生部、國家藥品監督管理局和國家工商局關于30個貴重藥材的通知品種，被列為出口創匯的主要品種[2]。同時，由于金銀花根系發達，耐旱、耐寒熱、耐瘠薄、耐鹽堿，因而又是水土保持和沙漠治理的良好樹種[3]。

我國忍冬科植物在全國各省各地形區均有分布，尤以西南地區種類最多，可供藥用的種類達47種，其中作為金銀花藥材原植物的有忍冬（Lonicera japonica Thunb.）、菰腺忍冬（Lonicera hypoglauca Miq.）、山銀花（Lonicera hypoglauca）和毛花柱忍冬（Lonicera dasystyla Rehd.），以山東平邑和河南封丘為道地產區[4]。隨著應用范圍的擴大和需求量的增加，金銀花野生資源逐漸減少，人工栽培已成為金銀花藥材的主要來源，山東、河南等省均有大面積的金銀花栽培種植基地[5]。不同種金銀花在株型、枝條、葉片形態及化學成分含量等方面均存在較大差異，種內遺傳變異十分顯著[5]。該研究利用RAPD分子標記技術對膠東地區31個金銀花品種進行遺傳多樣性分析，旨在探討不同金銀花品種間的遺傳關系，為該地區金銀花品種間的關系提供分子系統學資料，為進一步選育金銀花優良品種奠定理論基礎[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的金銀花材料為采自昆崳山、牙山、招虎山等膠東不同地區的27個品種，以及煙臺中醫世家引進的美國金銀花、四季豐、巨豐1號、大毛花4個優良的金銀花品種（表1）。

1.2 儀器和試劑

所用儀器有PTC-200基因擴增儀、微型離心機、凝膠成像系統、電泳儀、水平電泳槽和超微量紫外分光光度計。

試驗用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒、瓊脂糖、引物、RNA酶、TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer、Mg2+、dNTPs均購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取。

采集31個金銀花品種的幼嫩枝葉，稱取100 mg在液氮中充分研磨成粉末，利用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒提取金銀花基因組DNA，對提取的基因組DNA用超微量分光光度計檢測其濃度及純度，-20 ℃保存備用。

1.3.2 PCR反應。

利用設計的引物進行PCR擴增。反應體系總體積為25 μL，包括10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L的 Mg2+ 1.5 μL，2.5 mmol/L 的dNTPs 2 μL，10 ng/μL引物1 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶1 μL，20 ng/μL的DNA模板1 μL，ddH2O 16 μL。

擴增程序為94 ℃預變性2 min；94 ℃變性1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，40個循環；72 ℃延伸10 min。擴增結束后將反應產物于4 ℃保存。

1.3.3 電泳。

取10 μL PCR產物，加3 μL Loading Buffer，電泳。電泳結束后，將凝膠置于凝膠成像系統上觀察拍照。

1.4 數據分析

將電泳圖譜上清晰出現的條帶做出統計，由此生成原始矩陣。利用SPSS軟件計算任意2個品種間的遺傳距離，并利用該軟件的聚類分析方法建立不同種源間的遺傳關系樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 RAPD-PCR擴增結果

對供試的31個金銀花品種進行PCR擴增，對所用5個引物的擴增結果進行統計分析（表1）。5個引物共擴增出650條帶，不同引物擴增DNA片段數0～9條不等，分子量范圍為100～3 000 bp。650條DNA擴增帶中，585條帶具有多態性，多態條帶比率為90%，這表明供試的31個金銀花品種間RAPD條帶多態性高，遺傳多樣性豐富。

2.2 聚類分析結果

根據RAPD數據，利用SPSS軟件對31個金銀花品種間的遺傳距離和相似系數進行計算，并進行聚類分析，建立聚類分支樹狀圖[7]。由圖1可知，供試材料可分為兩類，樣品1（采自昆崳山太白頂）為一類，其余30個樣品為一類。而在剩余的30個金銀花品種中，樣品2（采自昆崳山林場）、3（采自乳山東夼鐘家）、4（采自文登新村）、7（采自棲霞牙山）、8（采自牟平磨石格莊）、14（采自招遠上院村）、16（采自海陽東村）、18（采自海陽招虎山東）、24（采自臨朐沂山居委會）、31（大毛花）為一類，剩余的部分為另一類。

根據31個金銀花品種間的遺傳距離可以看出，品種1（采自昆崳山太白頂）與品種31（大毛花）之間遺傳距離最遠，為2507；品種25[采自龍口蘭高鎮馬藺塂（Ⅱ）]與品種29（四季豐）遺傳距離最近為0.020，這與聚類分析結果相符。品種1（采自昆崳山太白頂）與品種31（大毛花）親緣關系最遠，品種25[采自龍口蘭高鎮馬藺塂（Ⅱ）]與品種29（四季豐）親緣關系最近。

3 討論與結論

RAPD分子標記被廣泛應用于作物品種或種子純度鑒定，具有簡便快速等優點，但也存在條帶穩定性差、飾演重復性低等問題[5，8]。為了保證試驗的準確性和可重復性，嚴格控制反應條件的一致性，每個引物多次重復，統計穩定出現、重復性高的條帶并進行遺傳分析，放棄重復性低的模糊條帶[5，9]。在此基礎上所獲得的數據是可靠的，試驗結果能真實反映膠東地區31個金銀花品種的遺傳特征。

從供試材料的聚類分析結果可以看出，樣品1（采自昆崳山太白頂）聚為一類，其余30個金銀花品種聚為一類。聚類結果與形態學分類相符。此外，31個金銀花品種遺傳多樣性豐富，表現出了不同的遺傳特征，品種間遺傳差異較大。而遺傳多樣性反映了物種的遺傳背景、育種潛力和利用價值[10]。通過對擴增條帶的分析，可以清楚地對供試31個金銀花品種進行分類，說明運用RAPD技術對金銀花進行分子水平的鑒定是可行的[11]，可以為供試31個金銀花品種的進一步開發利用提供詳細的分子生物學依據。

參考文獻

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