成熟油菜種子RNA提取方法的改良

摘要 [目的]從成熟油菜種子中抽提出高質量的RNA。[方法]該研究通過將天根植物總RNA提取試劑盒與康為世紀植物總RNA提取試劑盒相結合，使用β-巰基乙醇抑制酚類物質氧化，DNA酶去除DNA，并采用吸附柱有效去除多糖類物質等措施，對油菜種子RNA的提取方法進行有效改進。[結果]采用該方法能提取出質量高且完整性好的RNA，可一次滿足后續分子生物學研究的要求。[結論]該研究提出了一種高效快捷的成熟油菜種子RNA提取方法。

關鍵詞 油菜；成熟種子；RNA提取

中圖分類號 S565.4 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）13-0143-02

Improvement of RNA Extraction Method from Mature Rapeseeds

GU Si-kai1，2，CHEN Gui-min2，ZHAO Wen-jun2，JI Li-lian1，2* et al

（1.College of Food Science and Engineering， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225127；

2.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Ragional Modern Agriculture and Enverinment Protection， Jiangsu Key Laboratory for Eco-agricultural Biotechnology around Hongze Lake， School of Life Science， Huaiyin Normal University， Huaian， Jiangsu 223300）

Abstract [Objective]To extract high quality RNA from mature rapeseeds.[Method]To improve the RNA extraction method of mature rapeseeds by using two RNA extraction kits， which include RNA plant plus reagent from TIANGEN and CW2598M from KANGWEI， meanwhile， adding β-mercaptoethanol to inhibit the oxidation of phenolic compounds and removing DNA by DNase， using the adsorption column to remove polysaccharides etc. [Result]This method can get RNA with high quality， which can satisfy the requirements of subsequent molecular biology research.[Conclusion]The study provides an efficient method for extracting RNA from mature rapeseeds.

Key words Rape；Mature seeds；RNA extraction

RNA提取技術不僅是分子生物學的重要組成部分，而且是功能基因組學的基礎[1]，提取高純度、高完整度的植物組織RNA是進行基因克隆、RNA序列分析、狹線雜交以及構建cDNA文庫研究的前提[2-3]。因此，如何快速高效地獲得高質量的RNA成為科研人員關注的問題。

油菜是世界四大油料作物之一，成熟油菜種子中含有大量的脂肪、蛋白質、色素、單寧、多酚等物質，豐富的多酚類物質在RNA提取過程中易形成沉淀并發生褐化反應，同時抑制酶的活性等[4-5]。目前已經報道的RNA提取方法主要包括Trizol法[6]、皂土法[7]、Licl-尿素法[8]、改進SDS法[9]及CTAB法[10]等，這些方法都具有一定的局限性，特別對于次級代謝產物豐富、油脂及蛋白含量較高的材料，在總RNA提取過程中往往存在褐化、降解、低純度等現象[4，11-12]。針對目前油菜種子RNA提取存在的問題，該研究在前期工作的基礎上[2]通過多次試驗探索，提出了一種高效快捷的油菜種子RNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試油菜（甘藍型）播種于淮陰師范學院科技園，待油菜成熟晾曬后，剝出籽粒備用。

試驗操作中所需的離心管、槍頭、玻璃瓶、量筒、研缽、研杵、藥匙等經高溫高壓滅菌后用0.1%DEPC室溫浸泡處理24 h，再高溫高壓滅菌2次備用。電泳槽、制膠板、梳子等用3%過氧化氫溶液浸泡24 h，使用前分別用10%和0.1%的RNA酶固相清除劑先后處理5 min，最后用高壓滅菌的01%DEPC水清洗3次用于制膠。

RNA plant plus reagent植物總RNA提取試劑盒DP437-02（簡稱天根試劑盒）購自北京天根生化科技公司；β-巰基乙醇、50×TAE Buffer、RNase-Free ddH2O均購自上海捷瑞生物工程有限公司；康為世紀全能型植物RNA提取試劑盒CW2598M（簡稱康為世紀試劑盒）、DNaseⅠ、固相清除劑、Gold View、DEPC水均購自康為世紀生物科技有限公司。

1.2 油菜種子總RNA提取方法

1.2.1 試劑盒提取RNA法。

采用的試劑盒分別為天根生化科技公司生產的植物總RNA提取試劑盒RNA plant plus reagent和康為世紀生物科技有限公司生產的全能型植物總RNA提取試劑盒CW2598M，操作方法分別按照各公司的說明書進行。

1.2.2 基于2種試劑盒改良法。

將天根試劑盒和康為世紀試劑盒相結合，并對試驗步驟進行優化，具體步驟如下：

①取0.1 g成熟油菜種子放入已經使用液氮預冷的研缽中，并迅速研磨成粉末狀；

②在低溫狀態下將粉末轉入至2 mL的離心管中，并迅速加入800 μL含有β-巰基乙醇的RNA plant plus reagent提取液，渦旋振蕩至徹底混勻，離心管平放靜置5 min；

③將離心管置于已預冷的4 ℃離心機中，12 000 r/min離心2 min；

④上清轉移至新的RNase-Free的2 mL離心管中，緩慢加入1/2體積的無水乙醇，顛倒數次至徹底混勻，將混合液和沉淀一起轉入康為世紀試劑盒自帶的吸附柱RM（Spin Columns RM with Collection Tubes）中；

⑤向吸附柱內加入80 μL康為世紀試劑盒自帶的DNase Ⅰ 工作液，室溫下反應5 min；

⑥向吸附柱內加入康為世紀試劑盒自帶的Buffer RW1 350 μL，4 ℃12 000 r/min離心1 min，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中；

⑦向吸附柱內加入康為世紀試劑盒自帶的Buffer RW2 500 μL，4 ℃12 000 r/min離心1 min，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中；

⑧將含有吸附柱的收集管重新放回到離心機，4 ℃12 000 r/min離心1 min，充分去除吸附在膜上的液體；

⑨吸附柱RM轉入到RNase-Free的2 mL離心管中，于膜的中間部位懸空滴加RNase-Free ddH2O 30～50 μL，室溫放置2 min；

⑩于4 ℃離心機中最大轉速離心1 min，所得液體即為RNA溶液。

1.3 總RNA純度及完整性檢測

1.3.1 分光光度法測定。用無RNase的水作為空白對照，取5 μL溶解后的總RNA，用無RNase的水稀釋50倍，加入到夾縫比色皿中，使用艾本德公司生產的核酸蛋白測定儀Biophotometer plus檢測樣品RNA的濃度及純度。

1.3.2 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。移取已經溶解的RNA溶液5 μL于1%的瓊脂糖凝膠中，在150 V恒壓下電泳分離15 min，凝膠成像系統下觀察總RNA譜帶，以檢驗RNA的完整性。

2 結果與分析

2.1 總RNA濃度及純度測定結果

一般來說，較純凈的RNA OD260/OD280為1.8～2.0，若比值低于1.7表明有蛋白或酚類物質污染[13]。該研究將2個試劑盒結合并優化后，從0.1 g油菜種子中提取到的總RNA約為50 μg，RNA產量為0.5 mg/g，核酸蛋白測定儀測定結果表明OD260/OD280介于18～2.0，由此可見，該方法提取的RNA純度和濃度較高，能夠滿足后續試驗需要。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳結果

為了檢測提取的植物種子總RNA的完整性，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，通過電泳圖譜可以看出使用不同方法提取的RNA完整性有較大差別，使用天根試劑盒提取所得的RNA電泳條帶彌散嚴重，而使用康為世紀試劑盒提取后所得到的條帶無明顯彌散，但18S rRNA降解嚴重（圖1），得不到完整的18S rRNA條帶。將2種試劑盒相結合，并對提取方法進行優化后，分離得到的RNA電泳檢測結果顯示28S RNA與18S RNA 條帶帶型完整、無彌散現象，且前者的亮度約為后者的2倍（圖2）。

上述結果說明，采用2種試劑盒相結合的方法從成熟油菜種子中提取的總RNA具有較高完整性，無明顯降解現象，可以滿足從分子水平上對油菜種子相關基因進行深入研究的需要，如構建cDNA文庫、RNA印跡等。

3 討論與結論

作為重要的油料作物，油菜種子中含有大量的酚類、蛋白質、多糖及一些目前仍無法確定的次級代謝產物等。這些物質可與RNA結合并形成不溶于水的復雜混合物，該物質能夠與RNA發生共聚合反應，從而嚴重影響RNA的提取質量。因此，獲得高純度高完整性RNA的關鍵是去除蛋白質等大分子物質，同時有效防止酚類物質氧化[14]，抑制外源和內源RNA酶活性。作為構建cDNA文庫、研究遺傳等分子生物學的基礎，RNA的完整性直接影響后續研究結果。目前常用的試劑盒雖具有操作簡單、成本低等優點，但在油菜種子總RNA的提取過程中，存在酚類物質抑制不完全、提取時間長、蛋白類物質去除不干凈等弊端，最終導致提取的RNA質量和完整性偏低等現象，進而影響后續試驗的進行。

針對目前試劑盒提取RNA的弊端，該研究通過抑制內源RNA酶及多酚類物質、吸附蛋白質、縮短提取時間等方法提高RNA的質量和完整度。該方法選用天根總RNA提取試劑盒RNA plant plus reagent和康為世紀全能型植物RNA提取試劑盒CW2598M相結合，加入β-巰基乙醇來抑制酚類物質氧化和內源RNA酶的活性，康為世紀吸附柱和洗滌液有效吸附RNA并去除多糖類物質，整個試驗過程中盡量縮短抽提時間，控制在35 min以內，有效降低了提取過程中的降解和損失，解決了高酚高油類種子樣品中RNA提取的技術難點。使用該方法抽提的RNA具有質量高、完整性好等優點，完全能滿足后續的全長基因克隆、Northern雜交等分子生物學研究需求。

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