蓼藍組織培養再生體系的建立

周江波 陳家鴻 李會會

摘要[目的]建立蓼藍組織培養再生體系。[方法]以半野生蓼藍種子、幼葉和莖段為外植體，探討不同濃度植物激素配比的培養基對其愈傷組織誘導、繼代、分化及生根的影響。[結果]以蓼藍莖段為外植體進行組培是適宜的；誘導和繼代最佳培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L，平均誘導率可達73.33%；分化最佳培養基為6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.5 mg/L，平均分化率可達5167%；生根適宜的培養基為1/2 MS+NAA 0.5 mg/L，生根后移栽成活率達100%。[結論]該研究為優良蓼藍快速繁殖提供了新的途徑，并為其種質資源的保存與利用提供了依據。

關鍵詞蓼藍；組織培養；莖段；愈傷組織

中圖分類號S574文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）19-0123-03

Establishment of Regeneration System for Tissue Culture of Polygonum tinctorium

ZHOU Jiangbo， CHEN Jiahong， LI Huihui

（College of Environment and Life Science， Kaili University， Kaili， Guizhou 556011）

Abstract[Objective] To establish regeneration system for tissue culture of Polygonum tinctorium. [Method]Its seeds， young leaves and stems were used as explants to explore influences of media with different concentration hormone on callus induction， subculture， differentiation and rooting. [Result] Stems of P. tinctorium were ideal explants. The optimum medium for callus induction and subculture was MS+6BA 10 mg/L+2，4D 2.0 mg/L， the corresponding average induction rate was 73.33%. The optimum medium for callus differentiation was 6BA 10 mg/L +NAA 0.5 mg/L， the corresponding average differentiation rate was 51.67%. The optimum medium for seedlings rooting was 1/2 MS+NAA 0.5 mg/L. The surviving rate after transplanting attained to 100%. [Conclusion]The study provided a new way for P. tinctorium rapid reproduction，and provided theoretical basis for the preservation and utilization of germplasm resources.

Key wordsPolygonum tinctorium；Tissue culture；Stem；Callus

蓼藍（Polygonum tinctorium），亦略稱為藍或靛青，為蓼科蓼屬一年生草本植物，是自然界中含靛藍較多的一種植物。蓼藍被認為起源于印度，后被傳入中國、日本及歐洲，被廣泛用于天然植物染色[1-2]。目前蓼藍在我國南北地區均有分布，呈零星栽培或半野生狀態[3]。至今蓼藍仍是一些地區主要天然植物藍色染料的原材料[4-5]，苗、侗、瑤、布依等少數民族仍在大量使用蓼藍加工扎染[6]和蠟染民族工藝品[7] 等。另外，蓼藍還是常用的藥用植物，蓼藍種子和葉的甲醇-乙酸乙酯提取物表現出很強的抗氧化活性和抗癌效應[8]。Yu等[9]報道了蓼藍發酵的葉片提取物對HIV-1和HSV-1病毒有很強的抗性；Heo等[10]通過體外試驗揭示了蓼藍提取物可有效地抑制癌細胞的增殖；近年，韓國研究人員Park等[11]研究表明，經過超亞處理的蓼藍葉片有機溶劑提取物對人體的血清白蛋白有更高的抗氧化性和結合能力。

為保護蓼藍優異種質資源，滿足人們對其優質栽培及生產實踐的需求，探究蓼藍高效組織培養再生體系是有效途徑之一。目前國內外已有對蓼藍化學成分、生理功效及藥理作用分析等方面的報道，但對其組織培養再生體系的建立鮮見報道。該研究建立了蓼藍組織培養再生體系，以期為優良蓼藍快速繁殖提供新的途徑，為其種質資源的保存與利用提供依據，并對保留傳承和保護民族地區天然植物染料民族傳統工藝起到積極作用。

1材料與方法

1.1材料及消毒處理

供試蓼藍取自貴州省凱里經濟開發區覺雅村山坡地（107.97° E，26.59° N），為自然生長的半野生植株。分別選用蓼藍不同時期種子、幼葉和莖段作為外植體，接種前將外植體在無菌超凈工作臺上用蒸餾水沖洗干凈，在濾紙上瀝干，將其轉移至已滅菌的50 mL離心管中，用75%乙醇消毒2 min，無菌水清洗3次，再將3種外植體分別用0.1%的HgCl2溶液消毒處理10～12 min，無菌水沖洗5次，轉移至濾紙上瀝干，待接種。

1.2培養條件

以MS為基本培養基，分別添加不同種類和質量濃度的植物激素，篩選蓼藍組織培養生長各階段的最佳培養基。誘導和繼代培養基中添加不同配比的6-BA、2，4-D，6-BA質量濃度分別設為0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L；2，4-D質量濃度分別設為0、0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L，培養基pH 5.8，廣口瓶中接種后于培養室暗培養，室內培養溫度為（25±1） ℃，濕度為50%～60%。分化培養基中的植物激素用6-BA和NAA組合，6-BA質量濃度分別設為1.0、2.0、3.0 mg/L；NAA質量濃度分別設為0、0.5、1.0 mg/L，光照周期為16 h/8 h（光/暗）。每個處理接種20個（塊），3次重復。

1.3生根和移栽

蓼藍的生根培養，以1/2 MS為基本培養基，分別添加質量濃度為0、0.5、1.0 mg/L的NAA。待生根至1～2 cm后煉苗1～2 d，移栽至濕潤的營養土缽中生長。

1.4數據分析

數據采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。

2結果與分析

2.1不同外植體對蓼藍誘導愈傷組織的影響

對蓼藍種子、幼葉和莖段3種外植體分別消毒處理后，將其接種在誘導培養基上，暗培養一段時間后觀察各自的長勢。有些種子萌發出芽（圖1a），難以誘導出愈傷組織；幼葉誘導的愈傷組織較少且白色疏松（圖1b）；6 d后有些莖段兩端開始膨大，生長成紡錘體形狀，逐漸生長形成淡黃色致密的愈傷組織，莖段誘導的愈傷有些呈黃色致密結構，有些部位呈淺綠色，長勢較為緩慢（圖1c）。對外植體消毒處理相比較，種子顆粒過小，有殼，來自半野生植株的種子無菌操作污染率相對較高；幼葉取材時效性強；而莖段雖然誘導愈傷組織生長緩慢，但愈傷組織活力較好，且莖段消毒處理容易操作，效果較好。可見莖段是蓼藍誘導愈傷組織合適的外植體。

2.2不同培養基配比對蓼藍愈傷組織誘導的影響

從表1可看出，植物生長激素6-BA和2，4-D都對莖段愈傷組織的誘導起促進作用，2，4-D濃度對誘導效果有更大的影響，愈傷組織在添加2，4-D的培養基上發生得快，最早在誘導6 d后莖段兩端開始出現愈傷。不添加2，4-D時，莖段幾乎難以誘導出愈傷，而是形成不定芽。當2，4-D濃度為0～20 mg/L時，其對莖段愈傷組織的發生起促進作用，同時出芽率有所下降。莖段在培養基9（MS+6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L）中誘導培養，平均誘導率達到最大（7333%），且與其他培養基中的平均誘導率分別在0.05和0.01水平差異顯著。當2，4-D濃度繼續增大時，其愈傷組織受到了抑制，平均誘導率開始下降。6-BA濃度增大時，其對平均誘導率均有所抑制。綜合比較，適合蓼藍莖段誘導愈傷組織的培養基配方為MS + 6-BA 1.0 mg/L + 2，4-D 2.0 mg/L。

將誘導得到的愈傷組織轉至繼代培養基生長，繼代培養基采用與初代相同的誘導培養基配比（培養基9）。愈傷組織經過繼代培養塊狀增大，生長致密，呈一簇一簇的顆粒狀，顏色淡黃，生長旺盛。也有極少量愈傷塊出現褐化，少量顏色變得淺白，失去了分化再生出芽的能力。

2.3不同培養基配比對蓼藍愈傷組織分化的影響

為了獲得蓼藍再生植株的主苗，對繼代培養后的愈傷組織轉入分化培養基進行光照培養。經過28 d的培養，愈傷組織開始出現綠點（圖2a），致密飽滿，培養63 d后大部分胚性愈傷組織分化出苗（圖2b）。

由表2可知，隨著6-BA濃度的升高，分化率先增加，后逐漸降低，NAA濃度為0.5 mg/L時，分化率相對較大，愈傷組織平均分化率達51.67%，與其他培養基中的平均分化率分別在0.05和0.01水平上差異顯著。結果表明，適合蓼藍愈傷組織分化的培養基是6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.5 mg/L。

2.4生根與移栽

蓼藍愈傷組織分化的芽在1/2 MS + NAA 0.5 mg/L培養基中培養5～8 d開始生根，生根率達100%（圖3a），平均根長達1.8 cm，即可移出培養瓶煉苗1～2 d（圖3b），移栽至濕潤的缽土中種植（圖3c），補充水分以保溫保濕。移栽后5 d對幼苗統計，定植成活率達100%。移栽21 d后，幼苗開始長出多片新葉，保持良好的生長優勢。

3討論與結論

以天然染料植物為材料進行組織培養，不僅有利于保護山地少數民族地區植物的遺傳多樣性，民族藥用植物資源的可持續利用，而且可為優良種質資源鑒評和品種改良奠定基礎。貴州黔東南地處苗嶺山區，屬中亞熱帶季風濕潤氣候區，具有冬無嚴寒，夏無酷暑，雨熱同季的特點，年平均氣溫14～18 ℃，適宜蓼藍種植生長。蓼藍可持續利用對苗嶺山區少數民族文化的傳承有著重要的意義。但當前蓼藍野生或半野生分布零散，產量低，生長速度緩慢，種質資源良莠不齊，很大程度上制約了蓼藍在民族工藝上的規模化應用，而組織培養是蓼藍快繁的有效技術途徑之一。該試驗比較選用了蓼藍莖段為外植體進行組織培養，建立了蓼藍組織培養再生體系，從外植體的消毒及其愈傷組織的誘導、繼代增殖、分化再生及生根培養各個階段，比較分析了其生長適宜的最佳培養基配方。

蓼科植物以不同的外植體來進行組織培養目前均有報道，其中以莖段和幼葉作為外植體較為常見。柴瑞娟等[12]比較了蕎麥的幼莖和幼葉作為外植體誘導愈傷組織，結果表明幼莖在偏軟的培養基上誘導愈傷組織較為理想。劉明珍等[13]以酸模葉蓼帶腋芽莖段作為外植體進行離體培養，研究了進一步誘導生成完整植株的快繁技術。劉曉東等[14]以香蓼帶芽莖段為外植體，初步建立了香蓼組織培養快繁體系。該試驗中蓼藍種子較小，消毒接種易受污染，往往需去宿被再消毒而使操作效率降低，幼葉取材又受時間限制。綜合考慮，選用蓼藍莖段作為外植體較為適合，莖段取材便捷，便于消毒，易操作，污染率低，且愈傷組織誘導率較高。

該研究表明，植物激素6-BA、2，4-D均能促進愈傷組織的誘導，其中2，4-D濃度對愈傷組織的誘導有著更大的影響，且表現出明顯的質量濃度效應，適宜的植物激素濃度對愈傷組織起促進作用，而超過一定濃度，起抑制作用。這一結果與王鵬姬等[15]對蓼科蕎麥植物研究結果一致。劉曉東等[14]誘導香蓼腋芽誘導的最適培養基為MS + 6-BA 20 mg/L + NAA 0.1 mg/L，劉明珍等[13]比較篩選出酸模葉蓼最適的增殖培養基為 MS + NAA 1.0 mg/L + 6-BA 005 mg/L。該試驗中蓼藍莖段誘導愈傷組織的最佳培養基配方為MS + 6-BA 1.0 mg/L + 2，4-D 2.0 mg/L，愈傷組織分化的最佳培養基為6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.5 mg/L。綜合比較來看，6-BA、2，4-D在蓼藍愈傷組織誘導、增殖方面有著更大的影響，NAA在對蓼藍分化、生根方面有著很大的影響。

蓼藍愈傷組織的誘導及再生體系研究的建立，有望改善常規種植產量低、生長速度慢，少數民族地區需求量大的矛盾，可為蓼藍種質資源保護鑒評和品種遺傳改良提供物質基礎，并對利用天然植物染料的民族工藝起到保護和傳承的作用。

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