HPLC法測(cè)定煙臺(tái)柴胡中柴胡皂苷a和d的含量

劉文俊 陳海霞 ??

摘要[目的]建立煙臺(tái)柴胡中柴胡皂苷a、d含量的HPLC測(cè)定方法，研究煙臺(tái)柴胡中柴胡皂苷a、d的含量，為評(píng)價(jià)煙臺(tái)柴胡品質(zhì)提供科學(xué)方法。[方法]采用Thermo ODS-2 HYPERIL（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈和水，梯度洗脫；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。[結(jié)果]方法學(xué)考察表明柴胡皂苷a、d的峰面積積分值和進(jìn)樣量的線性關(guān)系良好，精密度試驗(yàn)的RSD分別為0.67%和0.75%；加樣回收率分別為99.4%和98.7%，RSD分別為1.53%和1.76%。不同來(lái)源的煙臺(tái)柴胡中柴胡皂苷a、d的含量相當(dāng)，總量在0.772%～1.079%。[結(jié)論]該方法穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)單，可用于煙臺(tái)柴胡的質(zhì)量控制。煙臺(tái)柴胡中柴胡皂苷a、d含量高于藥典規(guī)定的柴胡標(biāo)準(zhǔn)，可以作為柴胡的藥材新資源。

關(guān)鍵詞 煙臺(tái)柴胡；柴胡皂苷a、d；含量測(cè)定；高效液相色譜法

中圖分類號(hào)S567.7+9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）19-0119-02

Content Determination of Saikosaponins a and d in Bupleurum chinese DC.f.vanheuckii （Muell.-Arg.） Shanet Y.Li. by HPLC Method

LIU Wenjun1， CHEN Haixia2*

（1.Chest Hospital of Shandong Province， Jinan，Shandong 250013；2. Qilu Hospital of Shandong University， Jinan，Shandong 250012）

Abstract[Objective] The research aimed to provide scientific basis for evaluating the quality of Bupleurum chinese through establishing HPLC method to determine and study the content of saikosaponins a and d in it.[Method]Thermo ODS2 HYPERIL（250 mm ×4.6 mm，5 μm）column was used. Mobile phase was acetonitrilewater with gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min. Column temperature was 25 ℃ and the detection wave length was 210 nm.[Result]Methodology examination indicated that the linear relation between peak area integral value and saikosaponins a and d sample were good. RSD in precision experiment was 0.67% and 0.75%， respectively. Meanwhile， the respective recovery coefficient was 99.4% and 98.7%，RSD was 1.53% and 1.76%，respectively. There was only a little difference in the content of saikosaponins a and d that exist in Bupleurum chinese from different origins. The total content was between 0.772% and 1.079%.[Conclusion]This method was stable， simple and with good reproducibility， which can be used for the quality control of Bupleurum chinese. Saikosaponins a and d content in Bupleurum chinese is found higher than the standard content of which in Bupleurum chinense according to Chinese Pharmacopoeia， so Bupleurum chinese can be used as a new resource of bupleurum.

Key wordsBupleurum chinese DC.f.vanheuckii （Muell.Arg.） Shanet Y.Li.；Saikosaponins a， d；Content determination；HPLC

柴胡為我國(guó)常用的傳統(tǒng)藥材，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣之功效[1]。因在中醫(yī)臨床使用廣泛，野生資源幾近枯竭，市場(chǎng)流通多以人工栽培為主，目前我國(guó)栽培的柴胡品種主要為北柴胡[2]。煙臺(tái)柴胡[Bupleurum chinese DC.f.vanheuckii（Muell.-Arg.）Shanet Y.Li.]別名群胡，是北柴胡的變種[3]，主產(chǎn)于山東煙臺(tái)地區(qū)，分布于江蘇、吉林、遼寧、山西等地。目前，煙臺(tái)柴胡已被山東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)收錄[4]，但尚未被《中國(guó)藥典》收載。在柴胡用量日益增加、野生資源日益減少的情況下，開發(fā)柴胡藥材新資源、發(fā)展柴胡規(guī)范化種植是保證柴胡產(chǎn)量及質(zhì)量的重要手段。

柴胡皂苷是柴胡的主要有效成分，《中國(guó)藥典》以柴胡皂苷a、d的含量作為檢驗(yàn)藥用柴胡質(zhì)量的控制標(biāo)準(zhǔn)[5]。而煙臺(tái)柴胡在定量分析方面國(guó)內(nèi)鮮見報(bào)道。筆者通過建立HPLC測(cè)定煙臺(tái)柴胡中柴胡皂苷a、d的含量方法，以期為煙臺(tái)柴胡的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)，也為煙臺(tái)柴胡的應(yīng)用和優(yōu)良種質(zhì)的篩選提供試驗(yàn)基礎(chǔ)和技術(shù)方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器。Waters 600E高效液相色譜儀（杭州瑞析科技有限公司），包括600E四元梯度泵、2996二極管陣列檢測(cè)器、中文Empower色譜管理系統(tǒng)；LC-350超聲中藥提取機(jī)（濟(jì)寧市中區(qū)魯超儀器廠）。

1.1.2

試藥。柴胡皂苷a對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110777-201108），柴胡皂苷d對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110778-200507）；甲醇（色譜純，美國(guó)DNK公司）、乙腈（色譜純，美國(guó)DNK公司）；氨水（分析純）。

1.1.3

試材。煙臺(tái)柴胡采自山東煙臺(tái)及周邊地區(qū)，采收時(shí)間為9月上旬，經(jīng)山東省中醫(yī)藥專科學(xué)校張欽德教授鑒定為柴胡[Bupleurum chinese DC.f.vanheuckii（Muell.-Arg.）Shanet Y.Li.]的根及全草。

1.2方法

1.2.1溶液的制備。

1.2.1.1混合對(duì)照品溶液。精密稱取對(duì)照品柴胡皂苷a、d適量，加甲醇制成濃度分別為0.398和0.526 mg/mL的溶液。

1.2.1.2

供試品溶液。稱取煙臺(tái)柴胡粉末（煙臺(tái)昆崳山產(chǎn)地，過四號(hào)篩）0.5 g精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加入含5%濃氨試液的甲醇溶液25 mL，密塞，30 ℃水溫超聲處理（電流0.9 A，頻率40 kHz）30 min，濾過，用甲醇20 mL分2次洗滌容器及藥渣，洗液與濾液合并，回收溶劑至干。殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，045 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2

色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。色譜柱為Thermo ODS-2 HYPERIL（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）：水（B），梯度洗脫（0～25 min，40%～60% A；25～30 min，60% ～40% A）；柱溫為室溫（25 ℃）；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.3方法學(xué)考察。

1.2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密吸取“1.2.1.1”的混合對(duì)照品溶液，稀釋后得柴胡皂苷a對(duì)照品溶液濃度為0.398、0159、0.095、0.057、0.034、0.021 mg/mL，柴胡皂苷d對(duì)照品溶液濃度為0.526、0.210、0.126、0.076、0.045、0.027 mg/mL的溶液。按照“1.2.2”色譜條件測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2

精密度試驗(yàn)。取混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD值，要求該值小于3%。

1.2.3.3

穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10 h測(cè)定柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的峰面積并計(jì)算RSD值。

1.2.3.4

重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批號(hào)的柴胡樣品，按照“1.2.1.2”方法分別制備6份供試品溶液，以“1.2.2”色譜條件測(cè)定柴胡皂苷a、d的含量，并計(jì)算RSD值，要求該值小于3%。

1.2.3.5

回收率試驗(yàn)。精密稱取已知含量的煙臺(tái)柴胡粉末0.25 g共6份，分別精密加入對(duì)照品柴胡皂苷a、d適量，按照“1.2.1.2”方法制備供試品溶液。按照“1.2.2”色譜條件測(cè)定柴胡皂苷a、d的含量，計(jì)算加樣回收率和RSD。

1.2.4

樣品的含量測(cè)定。選取采自于煙臺(tái)周邊6個(gè)不同地區(qū)的煙臺(tái)柴胡樣品，按照“1.2.1.2”方法分別制備6批樣品的供試品溶液，按“1.2.2”色譜條件測(cè)定柴胡皂苷a、d的含量。

2結(jié)果與分析

2.1色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

在210 nm檢測(cè)波長(zhǎng)及相應(yīng)色譜條件下，繪制對(duì)照品及供試品色譜圖（圖1）。由圖1可見，對(duì)照品及供試品溶液中的柴胡皂苷a保留時(shí)間均為9 min，柴胡皂苷d保留時(shí)間均為16.2 min，樣品與其他組分峰的分離度>1.5，理論塔板數(shù)按柴胡皂苷d計(jì)不低于4 000。

2.2方法學(xué)考察

2.2.1

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。按照“1.2.3.1”操作，以峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），得出柴胡皂苷a、d的線性回歸方程分別為：Y=4.63×106X-1 707.8（ra=0.999 9）、Y=4.89×106X-5 731.6（rb=0.999 9），表明柴胡皂苷a進(jìn)樣量在0.21～3.98 μg、柴胡皂苷d進(jìn)樣量在0.27～5.26 μg與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2

精密度試驗(yàn)。按照“1.2.3.2”操作，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，計(jì)算柴胡皂苷a、d的RSD分別為0.67%和075%，表明儀器精密度良好。

2.2.3

穩(wěn)定性試驗(yàn)。按照“1.2.3.3”操作，測(cè)定柴胡皂苷a、d的峰面積，計(jì)算RSD分別為1.12%、1.23%，說(shuō)明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.4

重復(fù)性試驗(yàn)。按照“1.2.3.4”操作，測(cè)得柴胡皂苷a、d的RSD分別為1.56%、1.68%，說(shuō)明方法的重復(fù)性良好。

2.2.5

加樣回收率試驗(yàn)。由表1可見，柴胡皂苷a、d的平均回收率分別為99.35%和98.67%，RSD分別為1.53%和176%，表明該方法回收率好，方法可行。

2.3樣品的含量測(cè)定

方法確定并驗(yàn)證后，選取煙臺(tái)周邊6個(gè)不同地區(qū)的煙臺(tái)柴胡樣品，進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果如表2。由表2可知，煙臺(tái)萊陽(yáng)和煙臺(tái)牟平柴胡皂苷a的含量比較高，青島嶗山柴胡皂苷a的含量相對(duì)低；煙臺(tái)萊陽(yáng)和煙臺(tái)牟平柴胡皂苷d的含量比較高，煙臺(tái)牙山柴胡皂苷d的含量相對(duì)3討論與小結(jié)

采用HPLC法測(cè)定柴胡皂苷已有多種方法報(bào)道，流動(dòng)相可以選用甲醇和水[6-7]或乙腈和水[8-12]，但甲醇在檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm時(shí)，容易產(chǎn)生末端吸收干擾測(cè)定，該試驗(yàn)方法選用乙腈與水，具有更好的檢測(cè)結(jié)果。目前報(bào)道的檢測(cè)方法一般參照《中國(guó)藥典》方法進(jìn)行梯度洗脫，但柴胡皂苷a、d出峰時(shí)間較晚，分別于20和25 min左右出峰，筆者經(jīng)過多次試驗(yàn)確定洗脫條件，使出峰時(shí)間均提前至9和16 min左右，分離效果良好，縮短了測(cè)定時(shí)間。

該試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同來(lái)源的煙臺(tái)柴胡中柴胡皂苷a的含量為0.432%～0.545%，柴胡皂苷d的含量為0.326%～0.534%，表明煙臺(tái)周邊地區(qū)煙臺(tái)柴胡的質(zhì)量比較穩(wěn)定；柴胡皂苷a、d的總含量為0.772%～1.079%，超過2010版《中國(guó)藥典》中柴胡項(xiàng)下柴胡皂苷a、d總含量（0.3%）的規(guī)定，表明就皂苷類成分而言，煙臺(tái)柴胡可以作為柴胡的藥材新資源。

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