異常漢遜酵母和植物乳桿菌菌液濃度與光密度值的關系研究

江月 何松貴 周世水

摘要[目的]探索一種快速測定異常漢遜酵母和植物乳桿菌菌液濃度的方法。[方法]采用分光光度法測定菌液的光密度值（OD值），平板菌落計數法測定異常漢遜酵母和植物乳桿菌的菌液濃度，并研究兩者的相關關系。[結果]異常漢遜酵母在YEPD培養基中指數期的菌液濃度與光密度值呈現極顯著的線性相關關系，菌液濃度（y）與光密度值（x）線性回歸方程：y = 2.246x-0.030（R2=0.998 6） 。植物乳桿菌在MRS肉湯培養基中指數期菌液濃度的對數值與光密度值呈現極顯著的線性相關關系，菌液濃度的對數值（y）與光密度值（x）線性回歸方程：y=0.172 4x+8.432 1（R2=0.996 6）。[結論]分光光度法可用于快速測定異常漢遜酵母和植物乳桿菌菌液濃度。

關鍵詞異常漢遜酵母；植物乳桿菌；菌液濃度；光密度值；回歸方程

中圖分類號TS201.3文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）19-0099-02

Research on the Relationship between Bacteria Concentration and Optical Density of Hansenula anomala and Lactobacillus plantarum

JIANG Yue1， HE Songgui2， ZHOU Shishui1*

（1.College of Biological Science and Engineering， South China University of Technology， Guangzhou， Guangdong 510006； 2.Guangdong Jiujiang Distillery Co. Ltd.， Foshan， Guangdong 528205）

Abstract[Objective] To explore a rapid measurement for bacteria concentration of Hansenula anomala and Lactobacillus plantarum. [Method] Spectrophotometry and plate counting were used to determine the optical density （OD） and bacteria fluid concentration respectively， investigate the correlations between them. [Result] The correlations of the optical density with bacteria concentration were well. Bacterial concentration（y） and optical density （x） linear regression equation was established of Hansenula anomala YEPD medium in logarithmic phase： y = 2.246x-0.030 （R2 =0.998 6）. The logarithm of bacterial concentration （y） and optical density （x） linear regression equation was established of Lactobacillus plantarum MRS medium in logarithmic phase： y= 0.172 4x+8.432 1（R2 = 0.996 6）. [Conclusion] Spectrophotometric method can be used for rapid determination of Hansenula anomala and Lactobacillus plantarum bacteria fluid concentration.

Key wordsHansenula anomala；Lactobacillus plantarum；Bacteria fluid concentration；Optical density；Regression equation

作者簡介江月（1992—），女，湖北隨州人，碩士研究生，研究方向：麥芽飲料發酵工藝。*通訊作者，副教授，博士，從事發酵工程方面的研究。

收稿日期2017-04-28

酵母菌和乳酸菌是發酵飲料釀造過程中的重要菌種，對產品的風味和質量的穩定性具有重要影響。因此，發酵工藝中酵母菌和乳酸菌菌液的接種量對終產品的品質具有重要意義。一般意義上理解，接種量是指接入種子液的體積占接種后培養液體積的百分比。但是標準工藝中或科研中，需要對工藝進行精確控制，此時接種量一般是指所使用菌種濃度[1]。

菌液濃度一般采取2種測定方法[2-3]。一為平板菌落計數法，這種方法可以比較準確地測定菌液濃度，但是時間上有明顯的滯后性。二為比濁法，該方法可以迅速地判斷菌液濃度，但是誤差較大，準確性不高。

該研究擬采用分光光度法測定菌液的光密度值（OD值），平板菌落計數法測定異常漢遜酵母和植物乳桿菌的菌液濃度，并研究兩者的相關關系，探索一種快速測定異常漢遜酵母和植物乳桿菌菌液濃度的方法，為發酵飲料確定菌種濃度提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。異常漢遜酵母（Hansenula anomala）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）均為華南理工大學生物科學與工程學院實驗室保藏菌種。

1.1.2培養基。

YEPD培養基：酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0，115 ℃高壓滅菌20 min。YPD培養基：在YEPD培養基中加入20 g/L瓊脂粉，115 ℃滅菌20 min。

MRS肉湯培養基：稱取本品 52.4 g，蒸餾水 1 000 mL，115 ℃高壓滅菌20 min。配制固體培養基則再加入20 g/L瓊脂粉，115 ℃滅菌20 min。

1.1.3主要儀器。搖床，太倉市華利達實驗設備有限公司；生化培養箱，重慶市永生實驗儀器廠；752型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1種子液制備。酵母菌種子液的培養：接種一環斜面酵母菌于100 mL YEPD 培養基中，30 ℃、180 r/min 振蕩培養13 h，經 2～3 次傳代與擴大培養后制成酵母菌種子液，冷藏備用。

乳酸菌種子液的培養：接種一環活化后的斜面植物乳桿菌于100 mL MRS培養基中，35 ℃、180 r/min 振蕩培養13 h，經 2～3 次傳代與擴大培養后制成乳酸菌種子液，冷藏備用。

1.2.2培養液收集。向裝有100 mL YEPD培養基的三角瓶中接入2 mL酵母種子液，混勻后搖床培養（30 ℃，180 r/min），每隔2 h 取樣。

向裝有100 mL MRS液體培養基的三角瓶中接入2 mL乳酸菌種子液，混勻后搖床培養（35 ℃，180 r/min），前期每2 h取樣，后期每1 h取樣。

1.2.3光密度值測定。以未接種的培養基為空白對照，采用分光光度計（λ=600 nm）測定培養期間菌液的光密度值（OD600值），每份樣品做3個平行。若菌懸液太濃，應用未接種的培養基適度稀釋，使OD600 值在0.2～0.8范圍內。

1.2.4

平板菌落計數法測菌液濃度。無菌操作把培養液樣品搖勻后進行10倍梯度稀釋（稀釋度一般為10-4、10-5、10-6），分別吸取100 μL 稀釋液涂平板（3個平行），恒溫（30±1）℃培養 24～36 h后進行菌落計數。

2結果與分析

2.1酵母菌和乳酸菌生長曲線的測定

該試驗得出異常漢遜酵母和植物乳桿菌培養期間培養液的OD600值，并以培養時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，分別繪制酵母菌和乳酸菌的生長曲線，結果見圖1和圖2。

2.2異常漢遜酵母指數期菌液濃度與光密度值的關系

以OD600值為橫坐標，菌液濃度為縱坐標，運用Stata13軟件，繪制 XY 散點圖，線性擬合得出兩者的回歸曲線（圖3）。回歸方程為y=2.246x-0.030（R2=0.998 6），顯著性檢驗結果（F=8 356.11，P=0<0.01）表明兩者之間呈現極顯著的線性相關關系，這與馬勇等[4-5]的研究發現一致。

2.3植物乳桿菌指數期菌液濃度與光密度值的關系

以OD600值為橫坐標，菌液濃度的對數值為縱坐標，運用Stata13軟件繪制 XY 散點圖，線性擬合得出兩者的回歸曲線（圖4）。回歸方程為y=0.172 4x+8.432 1（R2=0.996 6），顯著性檢驗結果（F=281.83，P=0<0.01）表明兩者之間呈現極顯著的線性相關關系。同時研究發現，以OD600值為橫坐標，對數期的菌液濃度為縱坐標，回歸方程不顯著，這與嚴佩峰等[6]的研究結果有所不同。

3結論與討論

該試驗探索了一種快速測定異常漢遜酵母和植物乳桿菌菌液濃度的方法。通過對異常漢遜酵母和植物乳桿菌培養過程中光密度值（OD600值）的測定，結合平板菌落計數得到菌液濃度，建立了兩者的相關關系：異常漢遜酵母指數期菌液濃度（y）與光密度值（x）的回歸方程y = 2.246x-0.030（R2=0.998 6），植物乳桿菌指數期菌液濃度的對數值（y）與光密度值（x）的回歸方程y = 0.172 4x+8.432 1（R2=0.996 6）。通過分光光度法測定菌液的OD600值可以判斷菌體是否進入指數期，同時可以實時準確地掌握菌液濃度。

參考文獻

[1] 段夢奇，楊勇，徐恒，等.光密度測定法在百日咳桿菌培養菌液濃度測定中的應用[J].生物技術世界，2014（7）：121-122.

[2] 董自艷，戴翚，馬仕洪，等.紫外-可見分光光度法快速確定細菌菌液的濃度[J].中國藥品標準，2014，15（2）：120-121.

[3] 王改玲，宋云杰，高競鐸，等.畜牧業中4種常用有益菌濃度與吸光度的關系[J].江蘇農業科學，2016，44（7）：274-276.

[4] 馬勇，樊永軍.用OD值監測產油酵母培養過程中的菌體生物量變化[J].安徽農業科學，2011，39（12）：7342-7343.

[5] 馬勇，季祥，蔡祿.2種測定產油酵母菌生長曲線方法的比較[J].安徽農業科學，2011，39（14）：8202-8203，8233.

[6] 嚴佩峰，張孔海，李建芳.乳酸菌培養液中活菌數與吸光度的關系研究[J].信陽農業高等專科學校學報，2012，22（1）：110-112.