濃香型古井桃花曲中產香功能菌的研究

王志強 李蘭 湯有宏 李曉歡 姜利

摘要[目的]評估分析濃香型古井桃花曲中的特色產香功能菌株。[方法]從濃香型古井桃花曲中篩選出28株芽孢桿菌，以固態培養基為底物進行單菌產香試驗，并進行聞香評價。[結果]試驗得出有6株芽孢桿菌發酵后能夠產生濃郁的香味，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術對這6株芽孢桿菌的發酵產物進行揮發性成分檢測，并與古井貢酒中呈香物質進行對比分析，結果表明這些風味物質與白酒中呈香化合物基本一致。[結論]該研究為尋找濃香型古井桃花曲特色產香功能菌及提高白酒質量提供了理論依據。

關鍵詞古井桃花曲；篩選；產香微生物；揮發性成分

中圖分類號TS262.3文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）19-0090-02

The Study of Aromaproducing Functional Microorganisms in Gujing Liquor Peach Blossom Daqu

WANG Zhiqiang1，2， LI Lan1，2， TANG Youhong1，2 et al

（1.Anhui Gujing Distillery Co. Ltd.， Bozhou， Anhui 236820； 2.Anhui Solidstate Fermentation Engineering Technology Research Center， Bozhou， Anhui 236820）

Abstract[Objective] To evaluate aromaproducing functional microorganisms in Gujing liquor peach blossom daqu. [Method] Twentyeight strains of bacillus that produce flavor compounds were screened out from Gujing liquor peach blossom daqu. Solid state fermentation experiments of these types of bacillus were studied. They were cultured and tested for singlestrain aroma production by smelling the fragrance. [Result] The results indicated that six strains of bacillus were observed to produce rich flavors postfermentation by sensory analysis. The volatile components in fermentation products of the six strains were identified by headspace solid phase micro extractiongas chromatographymass spectrometry （SPMEGCMS）， and then were compared with the flavor compounds in Gujinggong strongflavor liquor. The results showed that these flavor compounds were basically the same with those in strongflavor Gujinggong liquor. [Conclusion] This study provides a theatrical basis for the application of aromaproducing functional microorganisms in Gujing peach blossom daqu and improvement of the quality of Gujinggong liquor.

Key wordsGujing liquor peach blossom daqu；Screening；Aromaproducing microorganisms；Volatile components

大曲的增香功能是由大曲中的產香微生物決定的，為了深入了解濃香型白酒的香味形成機理，進一步提高濃香型白酒的香氣品質，就必須對大曲中的產香微生物進行考察[1-3]，確定濃香型白酒的香味化合物主要由哪些菌種產生，在制曲過程中又代謝產生了哪些香味前體物質[4-5]。

近年來科研工作者們對大曲的研究逐漸聚焦到對產香菌的研究上，并取得了較好的成果。朱德文等[6]從醬香型大曲中分離鑒定出一株產香芽孢桿菌；張春林[7]從瀘州老窖大曲中分離鑒定出產香細菌；明紅梅等[8]從濃香型大曲微生物分離出能產生濃郁香味的X19和J3菌株。該研究選擇濃香型古井桃花曲中分離的28株芽孢桿菌類細菌進行固態發酵試驗，由技術人員進行感官分析，根據其香味不同，對其進行分類，并對具有特殊發酵味道的菌種進行氣質分析，以期評估古井桃花曲中的特色產香功能菌株。

1材料與方法

1.1材料

小麥固態培養基[8]：干燥小麥麥粒破碎為麥沙、麥粉各半，加等量水，浸潤18 h后，蒸熟、冷卻、打散，稱取70 g于250 mL三角瓶中，121 ℃滅菌20 min。營養瓊脂培養基，馬鈴薯培養基（PDA培養基）。

主要儀器：CP-WAX 50CB（50.00 m×0.25 mm×0.20 μm）毛細管柱，SX-70高壓滅菌鍋（日本，TOMY），MaxQ 485HP振蕩培養箱，Agilent 7890A-5975C氣相質譜聯用儀（GC-MS，配有電子轟擊源EI），Agilent PC420固相微萃取儀，CAR/PDMS 75 μm頂空固相萃取頭。

1.2方法

1.2.1菌種固態發酵氣相色譜分析的前處理。

固態發酵產物：取固態發酵產物10 g，加入70%無水乙醇50 mL浸泡30 min。在低溫條件下離心，轉速3 000 r/min，離心10 min，取上清液先進行粗過濾再用微孔膜過濾，得濾液，用10 mL移液管準確吸取10 mL濾液，加入0.1 mL內標混標（叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸），振蕩搖勻，倒入進樣小瓶，準備進樣。

1.2.2菌種固態發酵氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）分析的前處理。

固態發酵產物前處理同“1.2.1”，吸取發酵液50 mL，在低溫條件下離心，轉速5 000 r/min，離心10 min，取上清液，用移液管吸取濾液8 mL加入到頂空瓶中，稱取氯化鈉3.0 g加入到頂空瓶中，并加入一顆攪拌磁子，設置磁力攪拌器溫度為50 ℃，轉速400 r/min，PDMS萃取頭頂空萃取30 min。

1.2.3菌株的代謝產物分析方法。

1.2.3.1氣相色譜分析方法。

氣相色譜分析條件：色譜柱溫度35 ℃保持3 min，然后以5 ℃/min程序升溫至100 ℃，不保持，再以10 ℃/min升溫至195 ℃，保持18 min；載氣為氮氣，純度≥99.999%，流速1.0 mL/min；進樣量1 μL；進樣口溫度230 ℃；進樣方式為分流進樣，分流比60∶1。

1.2.3.2氣相色譜質譜聯用儀分析方法。

不分流，流速0.9 mL/min；進樣口溫度 230 ℃；升溫程序：35 ℃ 保持4 min，以2 ℃/min升溫到60 ℃，不保持，以6 ℃/min 升溫到180 ℃，保持15 min。

1.2.4菌種的固態發酵試驗。

酵母菌選用YPD培養基、細菌選用營養瓊脂培養基分別進行接種活化，分別置于28、35 ℃恒溫恒濕培養箱中培養24～48 h。從新鮮斜面上取2環菌種，接種到液體試管（每支試管裝液10 mL）中，28或35 ℃靜態培養36 h，制成種子液。取細菌種子液接種于固態法培養基中，35 ℃培養箱培養24 h，之后溫度上升至45 ℃培養24 h，溫度繼續上升至55 ℃培養72 h。以未接種的空白培養基作為對照，根據各菌株發酵液中風味成分的數量篩選產風味物質的功能菌種。

2結果與分析

選擇芽孢桿菌類的28株細菌進行固態發酵試驗。將菌株活化后，接種于小麥固態培養基，放入35 ℃培養箱培養24 h，之后溫度上升至45 ℃培養24 h，溫度繼續上升至55 ℃培養72 h。培養結束后由技術人員進行感官分析。根據感官分析結果，選擇有類似大曲香味的發酵樣進行氣相色譜質譜分析。

選擇芽孢桿菌類的28株細菌進行固態發酵試驗。55 ℃培養120 h時取出，由技術人員進行感官分析。根據其香味不同，將其分為8類：

①DAL10、BAL36、DAL01酸味，其中DAL10和DAL01酸味更重些。

②BAL44、BAL03、BAL13、BAL12小麥味，味淡。

③BAL16、BAL04、BAL41酸味加霉味，BAL16更重些。

④BAL17、BAL43酸味更重，霉味淡些，但比第3類味重。

⑤DAL07、DAL09餿茶葉味，比4類重，DAL07有臭味。

⑥BAL14、BAL18、BAL47、BAL29、BAL30、BAL46、BAL48、BAL33、BAL25、BAL11、BAL40為一類，味道比其他類重，有糊味，較臭，BAL48糊味更重。

⑦BAL22、BAL49與第6類相似，但有酸味。

⑧DAL06與其他不同，有曲香味，但較淡。

發酵感官分析結束后，挑選具有特殊發酵味道的DAL06、BAL48、BAL16、BAL17、BAL14、BAL22進行了氣質分析。結果見表1～6。

菌種固態發酵產物氣質分析結果表明，DAL06具有明顯的類似大曲發酵過程中的香味，2-羥基丁酮、2，3-丁二醇含量較高，這2類物質約占總香味成分的62.23%；而BAL48

具有焦糊味和酸味，且味道特別大，其分析結果顯示種類較多，與DAL06差異很明顯，主要的物質是嘧啶類、烷烴類和苯酚類。BAL16固態發酵產物中乙酸、四甲基吡嗪含量較高，這2類物質分別占總香味成分的48.94%、27.16%；BAL17發酵產物中主要含3-羥基-2-丁酮、四甲基吡嗪、2，3-丁二醇等物質，其含量分別占總香味成分的20.96%、51.08%、6.40%。

3結論

大曲是白酒釀造過程中重要的微生物、酶類、香氣物質和香氣前提物質的主要來源，其質量直接關系到白酒的酒質