毒死蜱降解菌的篩選?鑒定?降解特性

羅鑫 張海燕 邵彪 劉明元

摘要[目的]篩選毒死蜱降解菌，了解其特性。[方法]從常年施用毒死蜱農(nóng)藥的水稻田土壤中篩選出1株能以毒死蜱為唯一碳源和能源的降解菌。[結(jié)果]降解菌DC1對(duì)濃度100 mg/L毒死蜱15 d的降解率可達(dá)到83.3%。通過(guò)16S rDNA序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析，將該毒死蜱降解菌鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。系統(tǒng)發(fā)育表明，該菌和枯草芽孢桿菌的分支特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）的親緣關(guān)系最近。[結(jié)論]降解菌DC1來(lái)源于土壤，適應(yīng)性強(qiáng)，對(duì)解決土壤中毒死蜱殘留有一定的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞毒死蜱；生物降解；16S rDNA；枯草芽孢桿菌

中圖分類(lèi)號(hào)S482.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）19-0056-02

Isolation，Identification and Degrading Characteristics of A Chlorpyrifos Degrading Bacteria DC1

LUO Xin1，2，ZHANG Haiyan2，SHAO Biao1 et al

（1.Nantong Products Quality Supervision and Inspection Institute，Nantong，Jiangsu 226002； 2.Changzhou Environmental Monitoring Center，Changzhou，Jiangsu 213001）

Abstract[Objective]To screen chlorpyrifos degrading bacteria and understand their characteristics.[Method]A strain capable of utilizing chlorpyrifos as the sole carbon and energy sources was isolated form Chlorpyrifos used paddy soil.[Result]The results showed that the degradation rate of Chlorpyrifos was at 83.3% in liquid culture medium with 15 days.The phylogenetic analysis and 16S rDNA gene sequence analysis were applied to the bacteria classification，the strain was identified as Bacillus subtilis.The phylogenetic analysis also showed that the genetic relationship between strain DC1 and Bacillus tequilensis was propinquity.[Conclusion]The degrading bacteria DC1 was derived from soil and has strong adaptability，and has certain application value for solving soil poisoning ticks residue.

Key wordsChlorpyrifos；Biodegradation；16S rDNA；Bacillus subtilis

毒死蜱學(xué)名氯吡硫磷，是一種高效、廣譜、中等毒性的有機(jī)磷酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)殺螨劑，也是目前世界上生產(chǎn)和銷(xiāo)售量最大的殺蟲(chóng)劑之一。在我國(guó)，毒死蜱廣泛應(yīng)用于水稻、蔬菜、瓜果類(lèi)農(nóng)產(chǎn)品，尤其在禁止甲胺磷、對(duì)硫磷等5種高毒農(nóng)藥的銷(xiāo)售和使用后，毒死蜱的使用更加廣泛和頻繁。然而，農(nóng)藥的實(shí)際利用率極低，只有1%～10%施在作物上被利用，其余90%以上的農(nóng)藥或殘留于植物和土壤或進(jìn)入水體[1]。毒死蜱能夠通過(guò)皮膚接觸或呼吸作用進(jìn)入人體，并且在人體內(nèi)有累積現(xiàn)象，影響人的呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，并有一定的致畸性[2-4]。其在植物和土壤中殘留可通過(guò)食物鏈影響人們的健康[5]。

利用微生物降解環(huán)境中農(nóng)藥含量是一種高效、安全的方法，目前國(guó)內(nèi)外已有一些關(guān)于毒死蜱降解菌的報(bào)道。周淑云[6]從山東泰安某農(nóng)藥廠排污口的土壤中分離到1株施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）可降解毒死蜱；張利等[7]從農(nóng)藥廠廢水處理池污泥中分離到1株對(duì)毒死蜱有較強(qiáng)降解能力的菌株CH3，初步鑒定為哈夫尼菌屬（Hafnia sp.）。筆者以長(zhǎng)期施用毒死蜱農(nóng)藥的稻田土壤作為菌種來(lái)源，從中篩選出高效降解毒死蜱的菌株，同時(shí)因菌種來(lái)源于土壤，有較強(qiáng)的適應(yīng)性能夠適應(yīng)土壤環(huán)境，對(duì)微生物法降解毒死蜱尤其是解決土壤中毒死蜱殘留有較高的應(yīng)用價(jià)值。

1材料與方法

1.1儀器與設(shè)備

恒溫振蕩培養(yǎng)箱（太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；恒溫培養(yǎng)箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠）；壓力蒸汽滅菌器（上海醫(yī)用核子儀器廠）；標(biāo)準(zhǔn)凈化工作臺(tái)（上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；顯微鏡（1 000倍）；氣相色譜（安捷倫）。

1.2培養(yǎng)基

分離馴化培養(yǎng)基（MM培養(yǎng)基）：FeCl3·6H2O 0.1 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NH4NO3 0.5 g，KH2PO4 0.4 g，Na2HPO4 1.0 g，蒸餾水1 L。富集培養(yǎng)基（NB培養(yǎng)基）：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g（固體培養(yǎng)基時(shí)加入）、蒸餾水1 L。所有培養(yǎng)基均需調(diào)節(jié)pH至7.0，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.3毒死蜱降解菌的篩選

菌種來(lái)源于江蘇省南通市海安縣里下河地區(qū)常年耕種水稻并頻繁施用毒死蜱農(nóng)藥的田間，采樣深度為5～10 cm，采樣后碾散，于4 ℃保存。向50 mL含毒死蜱50 mg/L MM培養(yǎng)基中加入5 g土壤，于30 ℃ 120 r/min搖床培養(yǎng)3 d，取該混合液2 mL轉(zhuǎn)接入新鮮的MM培養(yǎng)基中，提高毒死蜱濃度至100 mg/L，3 d后再轉(zhuǎn)接并提高毒死蜱濃度至200 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，再重復(fù)轉(zhuǎn)接至毒死蜱濃度200 mg/L MM培養(yǎng)基中。將馴化后的菌液梯度稀釋1 000倍，吸取100 μL涂布至毒死蜱濃度200 mg/L NB固體培養(yǎng)基上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，挑取單菌落連續(xù)轉(zhuǎn)接3次。

1.4分離菌株鑒定

測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成，測(cè)序結(jié)果分別從上下游向中間進(jìn)行拼接。將獲得的16S rDNA菌株序列在NCBI網(wǎng)上進(jìn)行BLAST分析，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列進(jìn)行同源性比較分析。使用MEGA 5.0軟件采用鄰位連接法（Neighbour Joining）繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5毒死蜱的提取與檢測(cè)

毒死蜱的提取與檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[8]。

2結(jié)果與分析

2.1降解菌的分離和篩選

在對(duì)馴化后的菌液進(jìn)行涂布后，固體培養(yǎng)基上有一些菌落生長(zhǎng)，觀察其菌落特征可知，均極為相似，挑取其中1株單菌落連續(xù)轉(zhuǎn)接，獲得1株純化的毒死蜱降解菌，命名為DC1。DC1在NB平板上的菌落為乳白色，不透明，呈圓形，邊緣不整齊，表面粗糙。

2.2菌株DC1的系統(tǒng)發(fā)育

BLAST的結(jié)果顯示與菌株DC1最為相似的均為芽孢桿菌，相似度均超過(guò)99%，因此確定DC1為芽孢桿菌屬。圖1是根據(jù)菌株DC1的16S rDNA序列與同源性最高有代表性的15株菌構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化表明，DC1與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）最為相似。

2.3菌株DC1對(duì)毒死蜱的降解率

蘸取NB平板上的DC1單菌落至NB液體培養(yǎng)基，于30 ℃ 120 r/min培養(yǎng)48 h，此為降解菌菌劑。向100 mL含毒死蜱100 mg/L無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入5 mL菌劑，于30 ℃ 120 r/min培養(yǎng)15 d，分別在第5、10、15天吸取20 mL培養(yǎng)基測(cè)定毒死蜱的濃度。結(jié)果表明，第5、10、15天培養(yǎng)基中毒死蜱的濃度分別為58.9、32.4、16.7 mg/L，對(duì)毒死蜱的降解率分別為41.1%、67.6%、83.3%。

3結(jié)論與討論

（1）

從常年施用毒死蜱農(nóng)藥的水稻田土壤中篩選出1株能以毒死蜱為唯一碳源和能源的降解菌DC1，該菌對(duì)濃度100 mg/L毒死蜱第5、10、15天的降解率分別達(dá)到41.1%、67.6%、83.3%。通過(guò)16S rDNA序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析，可將該毒死蜱降解菌鑒定為枯草芽孢桿菌（B.subtilis）。枯草芽孢桿菌實(shí)際上是一個(gè)表型相似的群體，即枯草芽孢桿菌近緣種群（簡(jiǎn)稱(chēng)枯草群），他們包括枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、短小芽孢桿菌（B.pumilus）等10余個(gè)亞種，特基拉芽孢桿菌（B.tequilensis）也是其中之一。分離菌株DC1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，該菌和枯草芽孢桿菌的分支Bacillus tequilensis的親緣關(guān)系最近。

（2）微生物降解被認(rèn)為是農(nóng)藥尤其是有機(jī)磷農(nóng)藥降解最安全最可靠的途徑，分離和篩選出毒死蜱高效降解菌是毒死蜱污染治理、土壤修復(fù)的有效措施。該研究分離菌株DC1來(lái)源于土壤，能夠適應(yīng)土壤環(huán)境，對(duì)解決土壤中毒死蜱殘留有一定的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1]

李陽(yáng)，王玉玲，李敬苗.有機(jī)農(nóng)藥對(duì)土壤的污染及生物修復(fù)技術(shù)研究[J].中國(guó)環(huán)境管理干部學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，19（3）：64-66.

[2] PERERA F P，RAUH V，WHYATT R M，et al.A summary of recent findings on birth outcomes and developmental effects of prenatal ETS，PAH，and pesticide exposures[J].Neurotoxicology，2005，26（4）：573-587.

[3] SHERMAN J D.Chlorpyrifos （Dursban）associated birth defects：Report of four cases[J].Archives of environmental health，1996，51（1）：5-8.

[4] WHITNEY K D，SEIDLER F L，SLOKIN T A.Developmental neurotoxicity of chlorpyrifos：Cellular mechanism[J].Toxicology and applied pharmacology，1995，134（1）：53-62.

[5] KULKAMI A R，SOPPIMATH K S，DAVE A M，et al.Solubility study of hazardous pesticide （chlorpyrifos） by gas chromatography[J].Journal of hazardous materials，2000，80（1/2/3）：9-13.

[6] 周淑云.毒死蜱高效降解菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究[D].重慶：西南大學(xué)，2006.

[7] 張利，劉紅玉，曾光明，等.一株毒死蜱降解菌的分離鑒定及降解性能研究[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2008，2（10）：1421-1424.

[8] 楊麗，趙宇華，張炳欣，等.一株毒死蜱降解菌的分離鑒定及其在土壤修復(fù)中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)報(bào)，2005，45（6）：905-909.

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（19）：58-61，65