術(shù)前外周血循環(huán)腫瘤細胞檢測對原發(fā)性肝細胞肝癌微血管侵犯的預測價值

汪宇，李錫鋒，張小峰，王文超，別雅琴，施樂華

(第二軍醫(yī)大學東方肝膽外科醫(yī)院，上海200438)

·臨床研究·

術(shù)前外周血循環(huán)腫瘤細胞檢測對原發(fā)性肝細胞肝癌微血管侵犯的預測價值

汪宇，李錫鋒，張小峰，王文超，別雅琴，施樂華

(第二軍醫(yī)大學東方肝膽外科醫(yī)院，上海200438)

目的 探討術(shù)前外周血循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)檢測對肝細胞肝癌(HCC)微血管侵犯(MVI)的預測價值。方法 收集首次手術(shù)切除治療的HCC患者108例，術(shù)前未行抗腫瘤治療；術(shù)前取外周靜脈血檢測CTCs，術(shù)中取病理HE染色判斷是否發(fā)生MVI；收集患者臨床資料，進行發(fā)生MVI的單因素及多因素分析，以受試者工作曲線(ROC)判斷各獨立因素術(shù)前預測肝癌MVI的價值。結(jié)果 108例肝癌患者術(shù)前外周血檢出CTC 51例，術(shù)后病理證實發(fā)生MVI 44例，且發(fā)生MVI者外周血檢CTC 陽性檢出率高于未發(fā)生MVI者(P<0.05)。多因素分析顯示,CTC陽性(OR=5.218,95%CI1.700～16.011,P=0.004)、AFP>400 μg/L(OR=4.803,95%CI1.714～13.568,P=0.003)、DCP>40 mAU/mL(OR=3.046,95%CI1.055～8.797,P=0.040)和腫瘤直徑(OR=4.332,95%CI1.544～12.1521,P=0.005)是MVI發(fā)生的獨立危險因素。ROC 分析顯示，CTC陽性的曲線下面積及靈敏性、特異性均高于其他3種危險因素。結(jié)論 HCC患者術(shù)前外周血CTC檢測能較好地預測MVI的發(fā)生，可為后續(xù)個體化治療提供參考。

肝細胞肝癌；微血管侵犯；循環(huán)腫瘤細胞；預測價值；術(shù)前檢測

原發(fā)性肝細胞肝癌(簡稱肝癌)是全球最常見的惡性腫瘤之一[1]，其高復發(fā)率和病死率仍是制約患者總體療效的重要因素[2]。近年來，脫離了原發(fā)病灶侵襲并進入血液循環(huán)的循環(huán)腫瘤細胞(CTC)[3]被認為是惡性腫瘤患者術(shù)后復發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要因素[4]，在腫瘤診斷、治療、檢測等方面具有極其顯著的臨床價值。Li等[5]發(fā)現(xiàn),CTC與大血管侵犯(肝癌門靜脈癌栓)的發(fā)生相關，且影響患者的預后。但關于CTC與微血管侵犯(MVI)之間是否具有相關性，目前尚無相關報道。研究[6,7]表明，MVI是影響HCC患者術(shù)后復發(fā)及生存期的危險因素之一。目前臨床上對于MVI的診斷仍通過術(shù)后組織病理檢查，這極大影響了MVI對患者治療決策的選擇，也限制了其術(shù)前評估預后的作用。因此，需要尋找能夠在術(shù)前有效預測MVI的特異性細胞標志物。本研究探討了肝癌術(shù)前外周血CTC檢測對MVI的預測價值，為提高MVI診斷準確率及個體化治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標準：①術(shù)前經(jīng)B超、CT 和(或)MRI診斷為肝癌，無肝外轉(zhuǎn)移灶，術(shù)后病理證實為肝癌；②首次行手術(shù)切除治療，術(shù)前未接受任何化療、放療和其他治療；③術(shù)中切緣距腫瘤邊緣至少1 cm以上，邊緣陰性；④術(shù)前影像學檢查未見大血管侵犯；⑤排除全身情況差，肝功能Child-Pugh C級。收集2015年10月～2016年3月第二軍醫(yī)大學附屬東方肝膽外科醫(yī)院收治符合納入標準的患者108例，男71例、女37例，年齡(54.56±9.26)歲，總膽紅素(TBIL)>17.1 mmol/L 26例，白蛋白(ALB)<35 g/L 6例，前白蛋白<170 mg/L 53例，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)>44 U/L 39例，天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)>38 U/L 29例，堿性磷酸酶(ALP)>129 U/L 16例；HBsAg陽性71例，異常凝血酶原(DCP)>40 mAU/mL 54例，甲胎蛋白(AFP)>400 μg/L 49例；腫瘤直徑(4.72±1.95)cm，腫瘤單發(fā)51例、多發(fā)57例。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 術(shù)前外周血CTC檢測方法 術(shù)前采集患者外周血5 mL，置于含EDTA的抗凝管中，采用Ficoll-Paque PLUS分離液進行密度梯度離心；根據(jù)說明書以磁性標記的抗CD45單克隆抗體提取表達CD45的白細胞來富集CTC，用離心涂片機將富集到的細胞分在多聚賴氨酸玻片上制成細胞涂片。將載玻片與針對人去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)和氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)小鼠單克隆抗體和大鼠抗人CD45單克隆抗體的混合物共孵育，再用兔抗小鼠-Alexa Fluor647 IgG、兔抗大鼠-Alexa Fluor 488作為二抗孵育，隨后用DAPI染色。通過熒光顯微鏡(IX71；Olympus)評估染色的載玻片，調(diào)整檢測器靈敏度和曝光時間從標本捕獲陽性染色圖像。體積比較大，細胞核染呈陽性表達(藍色)，CPS1和ASGPR呈陽性表達(紅色)且CD45呈陰性表達(黃色未染)的細胞即為CTC[8]。

1.3 MVI判斷方法 術(shù)中病理取材部位及數(shù)量參照《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南(2015版)》[9]，對標本進行固定硬化，切成薄片，制成病理切片并行HE染色封片，顯微鏡下觀察有無MVI。MVI：微小靜脈(中央靜脈、門靜脈分支或包膜外小靜脈)內(nèi)漂浮有成團癌細胞，且周邊有明確的血管內(nèi)皮細胞環(huán)繞。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗；對單因素分析有意義的臨床指標，進行多因素logistic回歸分析發(fā)生MVI的危險因素；繪制ROC曲線，分析各危險因素的診斷效能。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌患者外周血CTC檢測結(jié)果和MVI發(fā)生情況 108例肝癌患者中術(shù)前外周血檢出CTC 51例，CTC陽性檢出率為47.2%；術(shù)后病理證實發(fā)生MVI 44例，且發(fā)生MVI者外周血CTC 陽性檢出率(75.0%)高于未發(fā)生MVI者(28.1%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 術(shù)前CTC對肝癌發(fā)生MVI的預測價值 單因素分析顯示，CTC陽性、AFP>400 μg/L、DCP>40 mAU/mL、腫瘤直徑和腫瘤數(shù)目與MVI發(fā)生有關,見表1；多因素Logistic回歸分析結(jié)果提示,CTC陽性(OR=5.218,95%CI1.700～16.011,P=0.004)、AFP>400 μg/L(OR=4.803,95%CI1.714～13.568,P=0.003)、DCP>40 mAU/mL(OR=3.046,95%CI1.055～8.797,P=0.040)和腫瘤直徑(OR=4.332,95%CI1.544～12.152,P=0.005)是MVI發(fā)生的獨立危險因素。CTC陽性的ROC曲線下面積(AUC)及靈敏性、特異性均高于AFP>400 μg/L、DCP>40 mAU/mL、腫瘤直徑。見表2。

3 討論

近年來，CTC被認為是肝癌術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移的一個主要根源，已成為研究腫瘤轉(zhuǎn)移復發(fā)過程和機制的一個重要切入點[10]。Kim等[11]曾提出過CTC相關的“種子”理論，認為從腫瘤原發(fā)灶脫落進入血液中的CTC能在血液相關趨化因子的作用下歸巢到腫瘤原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移部位。目前的研究結(jié)果已證實，肝臟腫瘤衍生的細胞因子或經(jīng)感染并發(fā)癥治療產(chǎn)生的炎性刺激物可上調(diào)細胞黏附分子，進而促進肝癌CTC附著于肝臟的門靜脈、肝靜脈血管內(nèi)皮，在血小板、組織因子及各種免疫細胞等的作用下形成CTC細胞簇，有利于血管癌栓的形成[12]。由此可見，CTC可能直接參與MVI的發(fā)生、發(fā)展，在肝癌患者術(shù)前預測MVI方面具有重要的診斷價值。研究[13]已證實,MVI是引起肝癌術(shù)后復發(fā)的重要原因之一，也是肝癌術(shù)后預后評估的一項危險因素。MVI被認為是反映腫瘤侵襲性的一項重要指標，而血管侵犯是腫瘤細胞脫離原發(fā)灶進入血液循環(huán)形成CTC最重要的途徑[14];MVI作為血管侵犯的主要環(huán)節(jié)，在CTC形成的過程中也可能起到一定的促進作用。此外，與單個腫瘤病灶進行活檢相比，CTC不僅創(chuàng)傷小，而且能夠更好地反映整個腫瘤的特性，因此被稱為“液體活檢”[15]。

表1 肝癌發(fā)生MVI的單因素分析結(jié)果

表2CTC、AFP、DCP、腫瘤直徑預測肝癌發(fā)生 MVI的敏感性、特異性及AUC

本研究就CTC在HCC術(shù)前預測MVI中的作用進行更深入的探索，除了應用單因素和多因素分析來篩選預測指標外，還應用ROC曲線來評價指標的臨床應用價值。本組資料顯示，108例肝癌患者MVI發(fā)生率為40.7%，與之前的報道相符[16,17]；并且，發(fā)生MVI患者外周血檢CTC 陽性檢出率高于未發(fā)生MVI者。這表明存在MVI的HCC患者腫瘤細胞更易侵犯血管并脫落進入血液循環(huán)形成CTC，進一步造成HCC的復發(fā)及術(shù)后遠處轉(zhuǎn)移，影響HCC患者的預后質(zhì)量。此外，本研究Logistic多因素回歸分析表明AFP>400 μg/L、DCP>40 mAU/mL、CTC陽性及腫瘤直徑是MVI發(fā)生的獨立相關因素，與之前報道的結(jié)果相一致[18]。但是，ROC分析結(jié)果顯示AFP、DCP在預測MVI方面的靈敏性及特異性均低于CTC，腫瘤直徑的靈敏度和AUC均低于CTC，因此CTC具有更高的預測診斷價值。

綜上所述，CTC在MVI預測方面具有較高的臨床價值，通過早期檢測CTC能夠在MVI發(fā)生的早期對其進行預測診斷進而干預治療。然而，本研究僅揭示了CTC與MVI之間的相關性，研究結(jié)果尚需進一步擴大樣本量來證實。我們后續(xù)將進一步對CTC在MVI形成中發(fā)揮的作用進行深入探究，推測CTC與微血管癌栓中的腫瘤細胞可能具有同源性，也許在基因水平同時檢測CTC與MVI中腫瘤細胞的表達能夠更深層次地揭示MVI的起源。未來能否將CTC的檢測運用至臨床，提高MVI的檢出率，仍是該領域需努力研究的方向。

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施樂華(E-mail： slhehbh@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.18.011

R735.7

B

1002-266X(2017)18-0033-03

2017-01-12)