苯并芘和4-溴聯苯醚聯合暴露對大鼠卵巢功能的影響及機制探討

鄧玉潔，劉慧，羅友紅，史文杰，龐偉毅

(桂林醫學院,廣西桂林 541004)

·基礎研究·

苯并芘和4-溴聯苯醚聯合暴露對大鼠卵巢功能的影響及機制探討

鄧玉潔，劉慧，羅友紅，史文杰，龐偉毅

(桂林醫學院,廣西桂林 541004)

目的 觀察苯并芘和4-溴聯苯醚(BDE-3)單獨及聯合暴露對雌性大鼠卵巢功能的影響，并探討其可能的損傷機制。方法 將60只大鼠隨機分為4組，于動情期A、B、C、組分別給予溶于玉米油的苯并芘、BDE-3、苯并芘聯合BDE-3 5 mg/(kg·d)等容灌胃法染毒暴露，D組給予玉米油5 mg/(kg·d)，連續灌胃28 d。于動情間期眼球取血，脫椎處死并獲取卵巢組織。采用ELISA 法檢測血清孕酮，分別采用熒光定量PCR、Western blot法檢測卵巢組織中的芳香烴受體(AhR)mRNA、細胞色素P450家族成員1A1(CYP1A1)蛋白。結果 A、B、C組血清孕酮水平及卵巢組織AhR mRNA、CYP1A1蛋白相對表達量均較D組增高，且C組各指標均高于A、B組(P均<0.05)；A、B組比較，差異無統計學意義。結論 苯并芘和BDE-3暴露對卵巢功能產生損傷效應，且聯合暴露可產生協同作用；其損傷機制可能是通過AhR調控CYP1A1表達，從而增強對卵巢組織的毒性效應。

苯并芘；4-溴聯苯醚；孕酮；芳香烴受體；細胞色素P450；大鼠

苯并芘是多環芳烴類(PAHs)中具有典型代表性的一種環境污染物，可刺激芳香烴受體(AhR)使其從細胞質轉入細胞核，與芳香族化合物受體核轉運蛋白(ARNT)結合并激活DNA上特定基因，如細胞色素P450家族成員1A1(CYP1A1)等，使DNA構象發生改變，引起相應靶基因的表達異常，從而對細胞產生毒性效應[1,2]。多溴聯苯醚(PBDEs)是公認的持久性有機物污染物，4-溴聯苯醚(BDE-3)是PBDEs脫溴最終降解的產物之一，具有生殖毒性、胚胎毒性、神經發育毒性以及內分泌干擾效應[3～5]。由于PAHs和PBDEs共存于大氣、水體和土壤環境中，毒效應譜有較大重疊，易在生物體內蓄積，影響人類健康。因此，研究二者的聯合作用具有重要意義。2015年11月～2016年6月，我們觀察了苯并芘和BDE-3單獨及聯合暴露前后雌性大鼠血清孕酮水平變化，探討其對卵巢功能的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雌性SD大鼠60只，體質量(180±20)g，8周齡，購自桂林醫學院實驗動物中心，合格證號SCXK桂2007-0001，飼養于桂林醫學院公共衛生學院實驗中心。

1.1.2 主要試劑 玉米油(Acros公司)，苯并芘、二甲基亞砜(DMSO)、BDE-3(Sigma公司)；大鼠孕酮試劑盒(北京華英技術研究所)，Allprep組織/細胞RNA/DNA/Protein 分提試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)；Fast Quant RT Kit、SuperReal PreMix Plus(北京天根生化科技有限公司)，引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成；蛋白質定量試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司)，兔抗鼠CYP1A1多克隆抗體(Millipore公司)，兔抗鼠β-actin多克隆抗體(Novusbio公司)。

1.1.3 主要儀器 微量核酸蛋白測定儀(Thermo公司)，實時熒光定量PCR儀(ABI公司)，全波長酶標儀(Thermo公司)，Wes全自動蛋白質印跡定量分析系統(Protein Simple公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與染毒處理 將大鼠隨機分為4組，每組15只。于動情期A、B、C、組分別給予溶于玉米油的苯并芘、BDE-3、苯并芘聯合BDE-3 5 mg/(kg·d)等容灌胃法染毒暴露，D組給予玉米油5 mg/(kg·d)，連續灌胃28 d。染毒結束后，于動情間期眼球取血，脫椎處死并獲取卵巢組織。

1.2.2 血清孕酮檢測 將全血以3 000 r/min離心5 min，取上層血清，用ELISA法檢測血清孕酮。

1.2.3 卵巢組織AhR mRNA檢測 采用熒光定量PCR法。采用Allprep劑盒提取卵巢組織的總RNA，按Fast Quant RT Kit合成cDNA，再用SuperReal PreMix Plus以cDNA為模板進行熒光定量PCR擴增。AhR上游引物5′-GGCCAAGAGCTTCTTTGATG-3′，下游引物5′-TGCCAGTCTCTGATTTGTGC-3′，產物長度93 bp；β-actin上游引物5′-CTACAATGAGCTGCGTGTG-3′，下游引物5′-TGGGGTGTTGAAGGTCTC-3′，產物長度121 bp。反應體系：2×SuperReal PreMix Plus 12.5 μL，正反向引物各0.75 μL，cDNA模板1 μL，50×ROX Reference Dye 0.05 μL，RNase-free ddH2O 9.95 μL。反應條件：95 ℃預變性15 min； 95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環。PCR實驗數據采用相對定量，以2-ΔΔCt法計算。

1.2.4 卵巢組織CYP1A1蛋白檢測 采用Western blot法。用Allprep試劑盒提取卵巢組織的蛋白并溶于1% SDS溶液中，按BCA法測定蛋白濃度。按Wes配套試劑盒操作步驟制備樣品(終濃度為0.2 μg/μL)，再按說明將樣品、生物素、封閉液、一抗、HRP標記的二抗及化學發光液抗體等試劑加入上樣板，室溫離心5 min(2 500 r/min)后上機進行全自動蛋白質印跡定量分析。Compass軟件將采集的熒光信號轉換為蛋白分子量數據及相應的表達圖譜，以樣本蛋白與內參蛋白的峰值面積比值表示該蛋白的相對表達量。

2 結果

各組大鼠血清孕酮水平及卵巢組織中AhR mRNA、CYP1A1蛋白相對表達量比較。見表1。

表1各組大鼠血清孕酮水平及卵巢組織AhR mRNA、 CYP1A1蛋白相對表達量比較

注：與D組比較，*P<0.05；與A組比較，#P<0.05；與B組比較，△P<0.05。

3 討論

大量研究[6～8]顯示，PAHs和PBDEs已成為多種腫瘤的危險因素，與乳腺癌、卵巢癌等的發生密切相關。孕酮由卵巢和腎上腺產生，在應激反應和下丘腦-垂體-腎上腺/性腺軸的調節方面具有重要作用。研究顯示，環境內分泌干擾物具有非單調劑量-效應性，表現為低劑量促進而高劑量抑制。研究發現，將小鼠出生前暴露于己烯雌酚(DES) 中，DES對前列腺發育產生低劑量增殖、高劑量抑制的倒U形劑量-效應關系。Tian等[9]研究發現,苯并芘染毒第3天櫛孔扇貝孕酮水平下降，而在第10天孕酮水平上升。表明苯并芘嚴重干擾了孕酮的正常波動，導致卵巢功能障礙。本研究結果顯示，苯并芘和BDE-3暴露大鼠血清孕酮水平增加，可能是低劑量暴露呈現的激活效應。

AhR是一類配體激活轉錄子，參與數種基因的調控，如外源性代謝酶CYP450中CYP1A1的形成，可在卵巢中分泌類固醇的間質細胞、卵泡顆粒細胞和黃體細胞中表達；被激活的CYP1A1能將環境中的多種有機物質如PAHs轉化為細胞毒素或其他致癌物質，從而增加癌癥發生危險。有研究[10,11]顯示，苯并芘能激活AhR誘導CYP450轉錄表達，將苯并芘代謝為活性化合物7，8-二氫二醇-9，10-環氧苯并(a)芘，與DNA形成加合物，導致卵巢顆粒細胞中活性氧的形成，從而損傷卵巢功能。Sobinoff等[7]發現，在卵巢中苯并芘通過激活AhR誘導CYP450代謝和氧化應激反應，使基因表達、細胞周期、細胞生長發育和細胞間的信號傳導等受影響，可激活未成熟的原始卵泡、損傷卵母細胞并使生長卵泡發生閉鎖，導致組織發生損傷效應。有研究[12,13]顯示，PBDEs可能通過激活AhR或誘導CYP450高表達等發揮致癌、致突變功能。Talsness等[14]研究發現，孕期雌性大鼠暴露于PBDEs，可導致卵巢細胞結構異常，影響生殖功能。目前國內外關于苯并芘的研究較多，BDE-3的研究較少，而同時探討兩者在哺乳動物體內聯合效應的研究更少。本研究結果顯示，苯并芘、BDE-3染毒的大鼠血清孕酮及卵巢組織中AhR和CYP1A1表達水平均較未染毒大鼠明顯增高，且聯合暴露較于苯并芘和BDE-3的單獨作用各指標增高更明顯。因此，我們認為苯并芘和BDE-3暴露對卵巢功能產生損傷效應，且聯合暴露可產生協同作用；其損傷機制可能是通過AhR調控CYP1A1表達，從而增強對卵巢組織的毒性效應。然而，關于兩者協同效應的機制尚需進一步研究。

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廣西自然科學基金資助項目(2013GXNSFBA019190)；廣西高校科學技術研究項目(2013ZD044)。

龐偉毅(E-mail： p.weiyi@live.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.18.008

R114

A

1002-266X(2017)18-0026-03

2017-02-23)