SGK-1在缺氧誘導小鼠垂體瘤細胞AtT-20增殖、凋亡中的表達及作用探討

韋睿, 吳杰, 曾偉, 張瑋

(昆明醫科大學第一附屬醫院，昆明650032)

SGK-1在缺氧誘導小鼠垂體瘤細胞AtT-20增殖、凋亡中的表達及作用探討

韋睿, 吳杰, 曾偉, 張瑋

(昆明醫科大學第一附屬醫院，昆明650032)

目的 觀察血清和糖皮質激素調節蛋白激酶1(SGK-1)在缺氧誘導小鼠垂體瘤細胞AtT-20增殖、凋亡中的表達，并探討其在這一過程中的作用。方法 將AtT-20細胞隨機分為觀察組和對照組，觀察組分別加入50、100、200 μmol/L CoCl2(模擬缺氧)，對照組不處理，采用MTT法檢測24、48、72、96 h時細胞增殖的A570值；將200 μmol/L CoCl2加入AtT-20細胞，培養0、24、48、72、96 h時采用流式細胞術測算細胞凋亡率，分別采用半定量PCR法和Western blot法檢測SGK-1 mRNA及蛋白。將AtT-20細胞隨機分為4組，A、B組轉染干擾質粒SGK-1 siRNA，C、D組轉染對照質粒siCon，轉染24 h后A、C 組加入200 μmol/L CoCl2，B、D組不處理，分別采用MTT法和流式細胞術檢測24、48、72、96 h時細胞增殖的A570值及細胞凋亡率。結果 缺氧處理72 h后，觀察組隨著CoCl2濃度增加及作用時間延長，AtT-20細胞增殖的A570值逐漸降低，與對照組比較差異有統計學意義(P均<0.05)。與0 h時比較，處理24、48 h時細胞凋亡率無明顯變化，處理72、96 h時細胞凋亡率增加(P均<0.05)；與0 h時比較，處理24、48時AtT-20細胞SGK-1 mRNA及蛋白表達量均增加(P均<0.05)，72 h后其表達量無顯著變化(P均>0.05)。A組缺氧后各時點細胞增殖的A570值均低于其余各組，C組缺氧后72、96 h細胞增殖的A570值高于A組而低于B、C組(P均<0.05)。A組缺氧后各時點細胞凋亡率均高于其余各組，C組缺氧后72 h細胞凋亡率低于A組而高于B、C組(P均<0.05)。結論 缺氧可抑制AtT-20細胞增殖、促進其凋亡，該過程中SGK-1表達增加可保護細胞免受缺氧導致的損傷。

腦缺氧；垂體瘤細胞；血清和糖皮質激素調節蛋白激酶；氯化鈷；基因干擾；細胞凋亡；細胞增殖

在大鼠乳腺癌細胞中，有學者通過糖皮質激素誘導轉錄表達的差異篩選發現了一種新的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，當細胞受到糖皮質激素或血清刺激時該蛋白表達迅速升高，所以將其命名為血清和糖皮質激素誘導蛋白激酶(SGK)[1]。有研究[2]表明，SGK在細胞受到外界刺激后對維持其存活起到重要作用。目前，SGK在腎臟[3]、心血管[4]、子宮等外周器官的作用研究比較多，但在中樞神經系統的作用相關研究較少。早期有研究[5]發現，在腦損傷部位SGK-1 mRNA 表達升高,提示SGK可能參與軸突再生。動物實驗發現，前腦局灶缺血可導致大腦皮質中SGK-1表達明顯增加,提示SGK作為一種即早基因,在全腦缺血應激條件下迅速被誘導、轉錄及表達[6～10]。2014年9月～2016年3月，我們觀察了SGK-1在缺氧誘導小鼠垂體瘤細胞AtT-20增殖、凋亡中的表達變化，以初步闡釋SGK-1在腦缺血過程中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與缺氧誘導 小鼠垂體瘤細胞AtT-20購自中國科學院昆明細胞庫，培養于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中；每1～2天換液1次，3～4 d離心傳代1次。用CoCl2刺激細胞模擬缺氧環境[11]:用50～200 μmol/L的CoCl2刺激細胞96 h，將細胞置于5% CO2培養箱中37 ℃培養。

1.2 缺氧對細胞增殖、凋亡影響的觀察

1.2.1 細胞增殖情況觀察 采用MTT法。取對數生長期的AtT-20細胞，以1×104/mL的密度接種于96孔板中，接種體積為200 μL/孔。培養8 h穩定后隨機分為觀察組和對照組，觀察組分別加入50、100、200 μmol/L CoCl2，對照組不處理，每個孔設置5個復孔。孵育24、48、72、96 h后，每孔中加入5 mg/mL的MTT(Sigma公司)溶液20 μL，繼續培養4 h后輕輕吸去上清；加入150 μL DMSO(上海生工生物工程股份有限公司)，震蕩15 min，用酶標儀測定570 nm的吸光度，以A570值表示細胞的增殖情況。

1.2.2 細胞凋亡情況觀察 采用流式細胞術。取對數生長期的AtT-20細胞，以1×104/mL的密度接種于96孔板中，接種體積為200 μL/孔。培養8 h穩定后，加入200 μmol/L CoCl2；分別于孵育0、24、48、72、96 h時，用PBS洗滌2次，進行Annexin V/PI雙染色(南京凱基生物科技發展有限公司)，上流式細胞檢測凋亡細胞，計算細胞凋亡率。

1.3 缺氧對細胞SGK-1表達影響的觀察

1.3.1 SGK-1 mRNA 檢測 采用PRC半定量法。細胞接種及處理同1.2.2，使用RNA Simple總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取各組細胞總RNA，定量后用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(大連寶生物工程有限公司)合成cDNA第一鏈；以cDNA第一鏈為模板進行PCR反應，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物并對其進行半定量，以2-ΔΔct計算其相對表達量。SGK-1上游引物5′-CTCCGCCAAGTCCCTCTCAACAAAT-3′，下游引物5′-CTCATACAGGACAGCCCCAAGACAC-3′，產物長度644 bp；GAPDH上游引物為5′-AATGCATCCTGCACCACCAA-3′，下游引物為5′-GTAGCCATATTCATTGTCATA-3′，產物長度513 bp；擴增反應：95 ℃預變性10 s；60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，40個循環；99 ℃退火60 s。

1.3.2 SGK-1蛋白檢測 采用Western blot法[12]。細胞接種及處理同1.2.2，用RIPA裂解液裂解細胞，12 000 r/min離心取上清；用Bradford法定量后行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔上樣量為30 g總蛋白。電轉移至PVDF膜，并用3% BSA封閉2 h；用SGK-1抗體(美國Invitrogen公司)孵育4 h，PBS緩沖液沖洗3次；二抗孵育2 h， 用PBST緩沖液沖洗膜3次，每次沖洗10 min，最后再用PBS緩沖液沖洗1次，結合HRP底物ECL發光液用BIO-RAD Chemical XRS+顯影系統顯影得到條帶圖像。圖像的蛋白條帶灰度用Image J 3.0軟件定量，以目標蛋白與對應內參灰度比值為目標蛋白的相對表達量。

1.4 降SGK-1表達對缺氧環境下細胞增殖、凋亡影響的觀察

1.4.1 細胞分組與轉染處理 取對數生長期的AtT-20細胞，以1×104/mL的密度接種于96孔板中，接種體積為200 μL/孔。培養8 h穩定后隨機分為4組，A、B組轉染干擾質粒SGK-1 siRNA(Santa Cruz公司)，C、D組轉染對照質粒siCon(Santa Cruz公司)，使用HiPerFect(Qiagen公司)轉染細胞24 h。然后A、C 組均加入200 μmol/L CoCl2，B、D組不予處理。

1.4.2 細胞增殖、凋亡觀察 取培養24、48、72、96 h 的細胞，分別按照1.2.1、1.2.2的方法觀察各組細胞增殖、凋亡情況。

2 結果

2.1 缺氧對AtT-20細胞增殖的影響 缺氧處理72 h后，觀察組隨著CoCl2濃度增加及作用時間延長，AtT-20細胞增殖的A570值逐漸降低，與對照組比較差異有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組細胞增殖情況比較±s)

注：與對照組同時點比較，*P<0.05；與觀察組50 μmol/L同時點比較，#P<0.05；與觀察組100 μmol/L同時點比較，△P<0.05 。

2.2 缺氧對AtT-20細胞凋亡的影響 200 μmol/L的CoCl2處理細胞0、24、48、72、96 h時，細胞凋亡率分別為10.32%±3.15%、11.26%±3.02%、11.32%±3.25%、19.87%±4.31%、24.41%±5.09%；與0 h時比較，處理24、48 h時細胞凋亡率無明顯變化，處理72、96 h時細胞凋亡率增加(P均<0.05)。

2.3 缺氧對AtT-20細胞SGK-1表達的影響 200 μmol/L 的CoCl2處理24、48時AtT-20細胞SGK-1表達均增加(P均<0.05)，72 h時其表達量與未處理(0 h)的細胞基本持平(P>0.05)。見表2。

表2200 μmol/L 的CoCl2處理不同時間AtT-20細胞SGK-1表達比較

注：與0 h時比較，*P<0.05。

2.4 SGK-1表達對缺氧環境下細胞增殖和凋亡的影響

2.4.1 各組細胞增殖情況比較 A組缺氧后各時點細胞增殖的A570值均低于其余各組，C組缺氧后72、96 h細胞增殖的A570值高于A組而低于B、C組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組細胞增殖情況比較±s)

注：與B、D組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

2.4.2 各組細胞凋亡情況比較 A組缺氧后各時點細胞凋亡率均高于其余各組，C組缺氧后72 h細胞凋亡率低于A組而高于B、C組(P均<0.05)。見表4。

表4 各組細胞凋亡率比較

注：與B、D組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

3 討論

足夠的血液和氧氣供應對維持腦的正常功能非常重要，腦缺血可導致腦組織死亡。因此，探索腦缺血后細胞凋亡以及保護自身細胞的機制，對于理解和治療腦缺血相關疾病有相當重要的意義。SGK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有廣泛的生理功能，其表達及活性增加參與多種疾病病理過程的發生和發展[13～15]。研究發現，SGK1在全腦缺血再灌注損傷的大鼠海馬細胞中表達明顯增加，而在損傷的神經元細胞中也有上調趨勢；推測SGK-1表達可能參與維持腦細胞存活的過程，從而減少腦缺血引起的腦損傷。有研究在細胞水平上發現，腎上腺素受體介導的抗凋亡信號與SGK-1有關[16～18]。因此，有充分的理由推測SGK-1表達可能參與腦缺血過程中對腦細胞的保護，我們的研究正是基于這些前期基礎和推測開展的。

我們用CoCl2刺激細胞模擬細胞缺氧，并檢測缺氧對垂體瘤細胞AtT-20增殖的影響；發現短期(24～48 h)的低氧刺激對細胞增殖并沒有太明顯的影響，甚至可以對細胞增殖有一定的促進作用，而長期的低氧刺激則明顯抑制了細胞的增殖。長期低氧刺激抑制細胞增殖是在預料之中的，而短期刺激導致的促細胞增殖則可能是因為低氧刺激誘導的其他因子導致了細胞增殖的加快，也可以理解為細胞對低氧刺激做出的一種應激反應。對細胞凋亡的研究也發現，CoCl2刺激在短時間并不會明顯誘導細胞凋亡，而在刺激72 h后則可明顯誘導細胞凋亡。對SGK-1在受到CoCl2刺激缺氧后表達的研究發現，CoCl2刺激在24、48 h均可以誘導SGK-1表達，而隨著時間的延長SGK-1回復到正常水平。這些結果都說明，SGK-1可能在低氧誘導早期為維持細胞生存起到一定作用。為了驗證上述推測，我們采用了RNA干擾的方法降低SGK-1在細胞內的表達。如果我們的推測正確，干擾SGK-1表達則必將加劇低氧誘導的增殖抑制，并增加細胞凋亡率。而我們的結果與推測非常吻合，這說明SGK-1在AtT-20受到低氧刺激后，能夠迅速表達上調，從而激活相關信號通路，維持細胞生存并抑制細胞凋亡。

綜上所述，本研究利用體外細胞缺氧模型，證明了SGK-1在腦缺血早期表達，起到保護腦細胞的作用。進一步研究SGK-1在腦缺血中的作用以及相關信號通路，有利于更好地闡述腦缺血保護的相關機制，并指導臨床診療。

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Expression and role of SGK-1 in hypoxia-induced proliferation andapoptosis of mouse pituitary tumor cells AtT-20

WEIRui,WUJie,ZENGWei,ZHANGWei

(TheFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,China)

Objective To observe the expression of serum and glucocorticoid-regulated kinase-1 (SGK-1) in mouse pituitary tumor cells AtT-20′s proliferation and apoptosis induced by hypoxia and to explore the role of SGK-1 in the process.Methods We classified AtT-20 cells into the observation group and control group randomly, then put 50, 100, 200 μmol/L CoCl2(for modulating the hypoxia) in the observation group while nothing was put in the control group, next, we tested the A570 value of cell proliferation at 0, 24, 48, 72, 96 h by MTT. We added 200 μmol/L CoCl2to AtT-20 cells, when the cells were cultured for 0, 24, 48, 72, 96 h, we calculated the apoptosis rate by flow cytometry, separately.Meanwhile, we detected the mRNA and protein of SGK-1 by semi quantitative PCR and Western blot. After that, we divided AtT-20 cells into 4 groups, cells in the groups A and B were transfected with interfering plasmid SGK-1 siRNA, and cells in the groups C and D were transfected with control interfering plasmid siCon. At 24 h after transfection, cells in the groups A and C were added with 200 μmol/L CoCl2, while cells in the groups B and D were not treated.Finally, we tested the A570 value and the apoptosis rate at 0, 24, 48, 72, 96 h by MTT and flow cytometry, respectively.Results At 72 h after hypoxia, A570 value of AtT-20 cells in the observation group decreased gradually with the increasing concentration and prolonged time, and difference was statistical significant as compared with that of the control group (allP<0.05). The apoptosis rate had no obvious change at 24, 48 h, and the apoptosis rate increased at 72, 96 h as compared with that at 0 h (allP<0.05). The mRNA and protein expression of SGK-1 increased at 24, 48 h (allP<0.05), but had no change at 72 h as compared with that at 0 h (allP>0.05). The A570 value in the group A at every time point after hypoxia was lower than that of the other groups, while the A570 value in the group C at 72, 96 h was higher than that of the group A and lower than that of groups B, C, meanwhile, significant difference was found between them (allP<0.05). The apoptosis rate in the group A at every time point after hypoxia was higher than that of the other groups, while the apoptosis rate in the group C at 72 h was lower than that of the group A and higher than that of groups B, C, meanwhile, significant difference was found between them (allP<0.05).Conclusion Hypoxia inhibits proliferation of AtT-20 cells and promotes its apoptosis, and the increasing expression of SGK-1 in the process protects cells from damage induced by hypoxia.

cerebral hypoxia; pituitary tumor cell; serum and glucocorticoid-regulated kinase (SGK); CoCl2; gene interference; cell apoptosis; cell proliferation

國家自然科學基金資助項目(81560319)；云南省應用基礎研究面上項目(2016FB130) ；云南省衛生科技計劃項目 (2016NS066)。

韋睿(1976-), 女, 主治醫師, 主要研究方向為急診科疾病的診治。 E-mail: 769320515@qq.com

張瑋(1975-),男, 副主任醫師,博士碩士生導師，主要研究方向為腦缺血與腦保護。E-mail: zhangwei7222@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.18.005

R739.41

A

1002-266X(2017)18-0016-04

2017-02-23)