膽固醇對人結腸癌細胞增殖、侵襲、遷移的影響及機制探討

陳心，伍龍，張一橋，陳能，徐細明

(武漢大學人民醫院，武漢430060)

·論著·

膽固醇對人結腸癌細胞增殖、侵襲、遷移的影響及機制探討

陳心，伍龍，張一橋，陳能，徐細明

(武漢大學人民醫院，武漢430060)

目的 觀察膽固醇對人結腸癌細胞增殖、侵襲、遷移的影響，并探討其機制。方法 將對數生長期的人結腸癌細胞株HT-29分為6組，A組不處理,B組加入膽固醇(終濃度1 μmol/L)處理48 h；C、D組和E、F組采用Lipofectamine 2000分別轉染陰性siRNA-HiperFect復合物、膽固醇酰基轉移酶1(ACAT1)基因siRNA-HiperFect復合物，轉染48 h后D、F組處理同B組。采用CFSE染色法通過流式細胞術檢測細胞增殖能力，以Transwell小室觀察細胞侵襲和遷移能力，利用Real time PCR法檢測細胞中的ACAT1 mRNA。結果 B、D組細胞增殖率、侵襲和遷移細胞數均高于其他組(P均﹤0.05)，其余組間兩兩比較差異無統計學意義。A、B、C、D、E、F組細胞中的ACAT1 mRNA相對表達量分別為0.96±0.02、1.48±0.05、0.94±0.02、1.44±0.02、0.54±0.36、0.63±0.05；B、D組細胞中ACAT1 mRNA相對表達量高于其他組(P均﹤0.05)，E、F組細胞中ACAT1 mRNA相對表達量低于其他組(P均﹤0.05)，A組與C組、B組與D組、E組與F組間兩兩比較差異無統計學意義。結論 膽固醇能提高人結腸癌細胞的增殖、侵襲、遷移能力，其可能通過促進ACAT1基因表達發揮作用。

結腸癌；膽固醇；膽固醇酰基轉移酶1；細胞增殖；細胞侵襲；細胞遷移

結直腸癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，全球結直腸癌的發病率和病死率分別位列所有癌癥的第3位和第4位。隨著我國人民生活水平的不斷提高，結直腸癌發病率和病死率逐年攀升，達到甚至超過了西方發達國家[1]。目前，結腸癌的治療方式以手術為主，但是術后復發和遠處轉移是手術無法解決的問題；對晚期或轉移不能手術者，放化療可改善患者生存情況，但療效有限。因此，研究結腸癌的發病機制，探索結腸癌治療的新藥物是改善患者預后的重要途徑。流行病學研究發現，高膽固醇血癥可增加結直腸癌的發病風險及死亡風險，且患者普遍存在糖耐量異常和膽固醇抵抗[2]。2016年1～12月，我們觀察了不同濃度膽固醇對人結腸癌細胞增殖、侵襲、遷移的影響，并通過抑制膽固醇代謝關鍵酶膽固醇酰基轉移酶1 (ACAT1)基因的表達以探討其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人結腸癌細胞株HT-29購自武漢大學生命科學研究院細胞庫，膽固醇(美國EMD Millipore 公司)，ACAT1 siRNA(美國Qiagen公司)；胎牛血清(美國Sigma 公司)，DMEM/F12培養基(美國Gibco公司)；Transwell小室(美國Corning公司)， Matrigel膠(美國BD公司)；羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯(CFSE，美國賽默飛世爾科技公司)，FACS Aria流式細胞儀(美國BD公司)；TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)，引物及Taqman探針合成(美國賽默飛世爾科技公司)，7500實時熒光定量PCR儀(ABI公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與分組處理 HT-29置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中，于37 ℃、5% CO2、95%濕度條件下傳代培養。將細胞按1×105/孔接種6孔板中，待細胞生長至70%～80%融合狀態時分為6組，均置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中；A組不處理,B組加入膽固醇(終濃度1 μmol/L)處理48 h；C、D組和E、F組采用Lipofectamine 2000分別轉染陰性siRNA-HiperFect復合物、ACAT1 siRNA-HiperFect復合物，轉染48 h后D、F組加入膽固醇(終濃度1 μmol/L)處理48 h。

1.2.2 各組細胞增殖能力觀察 采用CFSE標記法。收集各組細胞，用無血清培養基重懸，調整細胞密度為5×106/mL。加入CFSE 至終濃度為5 μmol/L，置 37 ℃ 培養箱，溫育 10 min；然后加入等體積胎牛血清中和，離心；加入PBS洗滌2次，收集細胞；培養72 h后，上流式細胞儀檢測；用FlowJo V10軟件圈定目標細胞群，根據分裂細胞的熒光強度，計算細胞增殖率。實驗重復3次。

1.2.3 各組細胞侵襲能力觀察 采用Transwell實驗。將Matrigel膠與無血清培養液按1∶3均勻地鋪在8 μm PCF細胞小室膜上，每孔50 μL；放入37 ℃ 培養箱中，孵育4～5 h使其凝結成膠狀。收集各組細胞，用無血清DMEM/F12洗3次，調節細胞密度至 5×105/mL。Transwell上層小室中加入200 μL細胞懸液(1×105/孔)，下層小室中加入500 μL含20% FBS的細胞上清，置于37 ℃培養箱中孵育24 h。取出Transwell小室，小心擦去小室底層膜和未穿膜的細胞；PBS沖洗小室膜3次，4 ℃下甲醇固定30 min，取出控干；加入結晶紫染色，倒置顯微鏡下計算5個視野的腫瘤細胞數。實驗重復3次。

1.2.4 各組細胞遷移能力觀察 采用Transwell實驗，操作方法同1.2.3，不同在于上室中不鋪Matrigel基底膜。

1.2.5 各組細胞中ACAT1 mRNA檢測 采用實時定量PCR法。取各組細胞，采用TRIzol一步法抽提細胞總RNA，使用TaKaRa逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應制備cDNA，采用SYBR Green I 熒光染料法進行實時熒光PCR。ACAT-1上游引物為5′-CAAGGCGCTCTCTCTTAGATGAAC-3′, 下游引物為5′-GATAAAGAGAATGAGGAGGGCAATAA-3′，引物長度為89 bp。反應條件: 94 ℃預變性 10 min； 94 ℃變性30 s, 55 ℃退火1 min, 72 ℃延伸2 min，共35個循環；最后72 ℃延伸10 min。用β-actin 作內參照，上游引物 5′-GAACGGTGAAGGTGACA-3′,下游引物5′-TAGAGAGAAGTGGGGTGG-3′，引物長度 168 bp。反應條件: 95 ℃預變性10 min； 95 ℃變性30 s, 57 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35個循環；最后72 ℃延伸10 min。在延伸的過程中搜集熒光信號, 于每次擴增的同時設置無cDNA的陰性對照。采用實時熒光定量PCR分析程序分析擴增結果, 以2-ΔΔCt表示ACAT1 mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 各組細胞增殖、侵襲和遷移能力比較 B、D組細胞增殖率、侵襲和遷移細胞數均高于其他各組(P均﹤0.05)，其余組間兩兩比較差異無統計學意義。見表1。

表1 各組細胞增殖、侵襲和遷移能力比較±s)

注：與A組比較，aP﹤0.01；與B、D組比較，bP﹤0.01。

2.2 各組細胞中ACAT1 mRNA相對表達量比較 A、B、C、D、E、F組細胞中ACAT1 mRNA相對表達量分別為0.96±0.02、1.48±0.05、0.94±0.02、1.44±0.02、0.54±0.36、0.63±0.05；B、D組細胞中ACAT1 mRNA相對表達量高于其他各組(P均﹤0.05)，E、F組細胞中ACAT1 mRNA相對表達量低于其他各組(P均﹤0.05)，A組與C組、B組與D組、E組與F組間兩兩比較差異無統計學意義(P均>0.05)。

3 討論

關于結腸癌的病因在世界各國做了大量研究，發現相對低發病地區的居民(如中國、日本、非洲等)移居到高發病率的西方國家后，結腸癌發病率隨之增高。研究各種環境因素后，發現生活方式和飲食在結腸癌的發展中起重要作用[3]。高發病率國家的居民飲食具有高脂肪、高動物蛋白、少谷物、少蔬果，即西方化飲食的特點，其中高脂肪飲食的影響最明顯；而另一方面，以低膽固醇為特點的地中海飲食和素食則會降低結腸癌的發病風險[4]。自上世紀90年代中期開始，我國大城市居民膳食中的脂肪產熱比例由十幾年前的25%猛增到了40%；同時，結腸癌的發病率開始不斷上升，每年遞增4.2%，比全球每年上升2%的平均數超出了近2倍。進一步研究發現，高脂肪飲食特別是動物脂肪,與結腸癌發生危險高度相關，脂肪攝入量高比攝入量低的人群患結腸癌的危險性明顯增加。對日本人群飲食結構的研究同樣發現, 食用肉類和動物脂肪多者，其結腸癌發病率明顯增加。大量研究已經明確，超重、肥胖、高脂血癥和癌癥的發展與癌癥相關死亡有著直接的聯系[5，6]。然而，高脂飲食是如何影響結腸癌的發生與發展,其機制尚未完全明確，存在各種假說，其中膽固醇的作用備受關注。

膽固醇是哺乳動物細胞膜的重要組成部分，其在細胞的生長分裂、穩定DNA雙螺旋結構和控制膜結合酶的活性中起著不可或缺的作用[7]。研究[8]發現，高膽固醇水平在腫瘤發展中起著重要作用。已有研究證實，高膽固醇可以刺激腫瘤生長。最新研究發現，膽固醇可以導致40余種基因的表達發生變化，而這些基因多與細胞的生長或凋亡相關，PI3K和MAPK等信號通路涉及其中。盡管許多研究試圖了解膽固醇在腫瘤增殖和轉移中的作用機制，然而具體哪些基因和信號通路如何參與其中仍未可知。

近年來，研究發現ACAT不僅與冠心病和阿爾茨海默病密切相關[9～11]，還與腫瘤細胞的發生與發展密切相關[12，13]。在膽固醇的吸收代謝過程中，ACAT的作用至關重要。其催化的膽固醇酯化反應無論在細胞水平還是個體水平的膽固醇代謝平衡中都發揮了極其重要的作用，是細胞內已知的惟一一種催化游離膽固醇與長鏈脂肪酸連接形成膽固醇酯的酶，是參與吸收、轉運和貯存膽固醇的一種極其重要的酶，可直接影響血液中膽固醇水平[14]。ACAT存在兩種形式：ACAT1和ACAT2。ACAT1 在幾乎各種組織和細胞中都有表達, 主要作用是維持細胞內膽固醇的代謝平衡；ACAT2 則只在肝臟和小腸細胞中表達，主要參與膽固醇的吸收和脂蛋白的裝配[15]。研究發現，ACAT/膽固醇酯化信號可能是促進腫瘤細胞增殖和侵襲的一種新途徑。在淋巴母細胞系CEM-CCRF的增殖過程中膽固醇酯必不可少,而ACAT抑制劑會影響細胞的增殖；在分離自患者的淋巴母細胞性T細胞白血病細胞中，伴隨ACAT mRNA水平增加的膽固醇酯化與細胞生長速率呈正相關[16]。在腦膠質瘤U87細胞中，也觀察到ACAT抑制劑能明顯降低腦膠質瘤U87細胞的增殖與侵襲[17]。另一方面，高膽固醇可以導致ACAT表達升高。Pramfalk等[18]在膽固醇負荷和缺失的條件下，分析人肝癌細胞株(HuH7和HepG2)ACAT的基因表達、酶活性及細胞內膽固醇含量；發現在膽固醇負荷條件下ACAT2 mRNA的表達上調，ACAT2酶活性增加，細胞內膽固醇含量增加，并呈現濃度依賴性，從而證實ACAT2對膽固醇代謝的調節發生在轉錄水平。

在我們的前期實驗中發現，ACAT1在結腸癌組織中的表達高于癌旁組織。為進一步探討ACAT1與結腸癌細胞生長與侵襲的關系，本研究以人結腸癌細胞株HT-29為細胞模型，探討高膽固醇對人結腸癌細胞增殖和侵襲的影響及其作用機制。結果顯示，膽固醇可促進HT-29細胞增殖，增加侵襲和遷移細胞的數量。通過siRNA抑制ACAT1基因的表達，則膽固醇促進腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移的作用得到抑制。結腸癌作為發病率、病死率迅猛上升的常見惡性腫瘤，不僅給患者帶來了巨大的痛苦，也給家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔。本研究發現，ACAT1在膽固醇與結腸癌發生中的關鍵作用，今后將探尋參與其中的信號通路，為結腸癌預防和治療增加新的手段。

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Effect of cholesterol on proliferation, invasion and migration of human colon cancer cells

CHENXin,WULong,ZHANGYiqiao,CHENNeng,XUXiming

(RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China)

Objective To observe the effect of cholesterol on the proliferation, invasion and migration of human colon cancer cells and to discuss the possible mechanism. Methods The human colon cancer cells HT-29 in the logarithmic growth phase were divided into 6 groups: group A without any treatment, group B which was added with cholesterol for 48 h (final concentration: 1 μmol/L), group C/D and E/F which were transfected by negative siRNA -HiperFect complexes and Acyl coenzyme A cholesterol acyltransferase 1 (ACAT1) gene siRNA-HiperFect complexes using Lipofectamine 2000, respectively. After 48 h, the cells in the groups D and F

the same treatment of group B. CFSE staining assay was used to evaluate the proliferation of cells. Transwell assay was used to evaluate the migration and invasion of cells. The expression of ACAT1 gene was detected by real-time PCR. Results The cell proliferation rate, the cell invasion and migration numbers in the group B and D were higher than those of the other groups (allP<0.05), and no statistically significant difference was found between any two of groups A, C, E and F. The relative expression of ACAT1 mRNA in the groups A, B, C, D, E and F was 0.96±0.02, 1.48±0.05, 0.94±0.02, 1.44±0.02, 0.54±0.36 and 0.63±0.05, the relative expression of ACAT1 mRNA in the groups B and D was higher than that of the other groups (all P<0.05), the relative expression of ACAT1 mRNA in the groups E and F was lower than that of the other groups (allP<0.05), and no statistically significant difference was found between group A/C, B/D and E/F.Conclusion Cholesterol can improve the proliferation, migration and invasion of human colon cancer cells by promoting ACAT1 gene expression.

colon carcinoma; cholesterol; cholesterol acyltransferase 1; cell proliferation; cell invasion; cell migration

國家自然科學基金資助項目(81302133)；中央高校基本科研業務費專項基金資助項目(2042014kf0149)；湖北省自然科學基金資助項目(2012FKC143)。

陳心(1981-)，女，博士,主治醫師,主要研究方向為結直腸癌腫瘤的發病機制與防治。E-mail： whdxchenxin@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.18.001

R730.3

A

1002-266X(2017)18-0001-04

2016-12-31)