野生大豆與栽培大豆雜交F1代ISSR多態性分析

熊振宇 李海波 余爽

摘要[目的]探究野生大豆與栽培大豆之間遺傳多態性的差異，以期為大豆雜交育種的親本選配提供理論依據。 [方法]用20對ISSR引物對野生大豆與栽培大豆及其10份雜種F1材料進行遺傳多樣性分析，探討野生大豆與栽培大豆之間的遺傳關系。 [結果]此次試驗共擴增出167條帶，其中121條為多態性帶，多態率達72.45 %；雜交F1代材料與其母本中黃19及父本ZYD04350間的平均遺傳相似系數分別為0.65和0.47。 [結論]栽培大豆與野生大豆雜交F1代材料間存在著豐富的變異，雜交F1代從母本獲得的遺傳物質多于父本。

關鍵詞野生大豆；栽培大豆；ISSR；多態性

中圖分類號S565.1文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）10-0137-03

ISSR Polymorphism Analysis of F1 Hybrids of Glycine soja and Glycine max

XIONG Zhenyu，LI Haibo，YU Shuang*（School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan，Hubei 430000）

Abstract[Objective] To sudy the difference of genetic polymorphism between Glycine soja and Glycine max，so as to provide theory evidence for Glycine max crossbreeding. [Method] Twenty primers were used for ISSR analysis on Glycine soja，Glycine max and 10 F1 hybrids，to study the genetic relationship of Glycine soja and Glycine max. [Result] Total 167 bands were amplified in the PCR reactions.Among them 121 were polymorphic bands and the polymorphic rate was 72.45%.The average genetic coefficients between Zhonghuang 19 and F1 progenies，ZYD04350 and F1 progenies were 0.65 and 0.47，respectively. [Conclusion]There was abundant genetic variation among F1 progenies derived from crossing between Glycine soja and Glycine max，

genetic material of F1 hybrids obtained from maternal was more than male parents.

Key wordsGlycine soja；Glycine max；ISSR；Polymorphism

大豆（Glycine max）作為重要的油料和糧食作物，在世界范圍內得到了廣泛種植。隨著栽培大豆品種推廣年限的延長，品種間的遺傳基礎日益狹窄，變異幅度逐漸變小，優異性狀不斷丟失[1-2]。因此優良種質資源的挖掘創新顯得十分重要。

野生大豆（Glycine soja）作為栽培大豆的祖先，在長期的自然選擇過程中，形成了極其豐富的變異類型，具有許多栽培大豆無法比擬的優勢：①野生大豆富含蛋白質，是一種高蛋白植物。徐豹等[3]、楊光宇等[4]研究表明，野生大豆的蛋白含量明顯高于栽培大豆，平均含量可達45.4%，最高達55.4%。②野生大豆單株莢數較多，種子繁殖系數較高。王克晶等[5-6]研究發現栽培大豆中一般種質每株莢數都在100個以下，而在野生大豆中一般每株莢數可達400～500個，甚至上千個。③野生大豆具有抗逆性強、適應范圍廣的特點。目前，相關學者已鑒定出抗旱、抗澇、抗鹽堿等對逆境脅迫有較強抗性的野生大豆材料[7-8]。同時對于野生大豆在抗灰斑病、蚜蟲、大豆胞囊線蟲病、花葉病毒等生物脅迫方面也有相關報道[9-10]。野生大豆作為栽培大豆的近緣野生種，兩者之間不存在種間雜交障礙和遺傳隔離，故可以通過雜交技術將優良野生大豆資源引入到栽培大豆育種研究中，這對大豆遺傳基礎的拓寬，優良新品種的選育等起到極其重要的作用[11-14]。

伴隨著分子生物學的發展，遺傳多樣性的檢測已從傳統的表型標記、同工酶標記發展到分子標記。AFLP、RFLP、RAPD等分子標記技術都在檢測植物遺傳多樣性研究中得到應用，但都存在一些缺點。AFLP分子標記操作較為繁瑣、耗時；RFLP分子標記技術需用到同位素，對人體傷害較大；RAPD分子標記技術穩定性差。而ISSR（Inter Simple Sequence Repeat，簡單序列重復區間）分子標記技術是 Zietkiewicz等[15]發明的，與其他分子標記相比，具有適用范圍廣、成本低、操作簡單、穩定性高和多態性豐富等特點。目前，ISSR分子標記技術在油菜[16]、水稻[17]、茶樹[18]、小麥[19]和百合[20]等植物的遺傳多樣性分析、基因定位、種子純度鑒定等研究中得到了廣泛利用。利用ISSR分子標記技術探討野生大豆與栽培大豆雜交F1代植株與其親本間遺傳多態性的差異，以期為大豆雜交育種的親本選配提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料。試驗材料為中黃19（栽培大豆）、ZYD04350（野生大豆）及其10個雜交F1代植株，材料名稱見表1。

1.2方法

1.2.1DNA提取。選取盛花期大豆植株頂部幼嫩的葉片，液氮保存。總DNA的提取采用CTAB法[21]，并根據大豆自身特點加以改良。DNA質量檢測采用1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.2 ISSR-PCR反應體系的建立。ISSR-PCR反應體系為2×PCR mix 12.5 μL，ISSR引物（10 ng/μL）2 μL，DNA模板（10 ng/μL）2 μL，補水至25 μL。反應程序為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，循環30次；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.3瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用20對多態性引物對試驗材料進行篩選，擴增產物利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，100 V電壓條件下電泳，直至標記染料完全跑出（約1 h）。電泳結束后于凝膠成像系統內分析、拍照。

1.3數據分析將瓊脂糖凝膠電泳圖根據條帶的有無轉化為0/1數據（有條帶的記1，無條帶的記0），利用NTSYSpc2軟件分析材料間的遺傳相似系數和構建聚類樹狀圖。

2結果與分析

2.1DNA質量檢測CTAB法提取植物材料葉片DNA，1%瓊脂糖電泳檢測結果如圖1所示， 所提DNA條帶清晰，無雜質、無降解，質量較高，可以用于后續試驗。

2.2ISSR-PCR擴增利用20對ISSR引物對野生大豆與栽培大豆及其10個雜交F1代進行擴增，各引物擴增的帶數及多態性條帶數目如表3所示。共得到167條帶，其中引物B2擴增帶數最多，為15條，引物B9和B15最少，為5條，平均每個引物擴增條帶8.15條。其中多態性條帶121條，多態率為72.45%。圖2是引物B2的PCR擴增產物電泳圖。

2.3親本及雜交F1代遺傳相似系數分析試驗利用20對ISSR引物對2個親本及其10個雜交F1進行多態性分析，將電泳結果轉化為0/1數據，并利用NTSYSpc2軟件進行遺傳系數分析，其結果如表4所示。2個親本間的遺傳相似系數最小為0.35，子代材料A1與A9之間遺傳相似系數最大為0.87。10個子代單株與母本的遺傳相似系數在0.55～0.71，平均遺傳相似系數為0.65。子代單株與父本間的遺傳相似系數在0.38～0.53，平均遺傳相似系數為0.47。

2.4親本及雜交F1代聚類分析 根據遺傳相似系數矩陣進行UPGMA聚類分析，結果如圖3所示。通過聚類圖可知，群體被分為二大類，第1類為父本，第2類為母本及雜交F1代單株，其可分為母本P1和雜交F1代二大亞支，在雜交F1代亞支中，又分為3個分支，第1分支包括A1、A9和A10，第2分支包括A2、A8、A3和A4，第3分支包括A5、A6和A7。親本P1與P2被分在二大類中，在聚類圖中距離最遠，說明雙親野生大豆與栽培大豆存在著不同的遺傳背景。母本與所有雜交F1代被分在第二大類中，說明雜交F1代與母本間的親緣關系更近。從圖3可以看出，母本P1、父本P2和所有雜交F1代分別處于3個亞支中，暗示在親緣關系上，雜交F1代之間比其與雙親間更近。

3結論與討論

該研究利用ISSR分子標記分析野生大豆與栽培大豆及其F1代的遺傳多態性差異，結果表明ISSR分子標記具有較高的多態性。其擴增產物檢測無須利用復雜繁瑣的聚丙烯酰胺凝膠電泳，2%瓊脂糖電泳即可很好地分辨，操作簡單，方便快捷。因此，ISSR作為一種良好的分子標記技術，在分子標記輔助育種和遺傳多樣性檢測等研究中有廣闊的前景[22]。

該研究中，雜交F1代及雙親在遺傳相似系數上有較大差異。親本野生大豆與栽培大豆間遺傳相似系數為0.35，為所有試驗材料中最小，說明野生大豆與栽培大豆間存在著遺傳多樣性的差異。另外，各子代材料與父本及母本的平均遺傳相似系數分別為0.47和0.65，低于父母本之間遺傳相似系數，暗示著子代材料已融合雙親遺傳物質。

通過雙親及雜交F1代的遺傳相似系數及聚類分析圖可以發現，雜交F1代存在不均等的獲得雙親遺傳物質的現象，這種不均等性表現為雜交F1代能更多地得到母本的遺傳物質。一個可能的原因是雜交F1代獲得母本的細胞質遺傳物質——線粒體及葉綠體基因。但在劉夢培等[23]的研究中，利用ISSR分子標記分析3個雜交組合及其子代的遺傳變異中僅有1個組合出現這種現象，說明此種現象不只是由細胞質遺傳造成的，還可能存在其他原因。同時在生產上將優良種質作為母本配制雜交組合，子代有更大幾率獲得更多母本的優良性狀，對雜交育種中的親本選配工作具有積極的作用。

參考文獻

[1]

袁翠平，沈波，董英山.中國大豆抗（耐）胞囊線蟲病品種及其系譜分析[J].大豆科學，2009，28（6）：1049-1053.

[2] CONCIBIDO V C，DIERS B W，ARELLI P R. A decade of QTL mapping for cyst nematode resistance in soybean[J].Crop science，2004，44（4）： 1121-1131.

[3] 徐豹，鄒淑華，莊炳昌，等.野生大豆（G.soja）種子貯藏蛋白組份11S/7S的研究[J].作物學報，1990，16（3）：235-241.

[4] 楊光宇.東北地區野生、半野生大豆在大豆育種中利用研究進展[J].大豆科學，1997，5（3）：259-263.

[5] 王克晶，李福山.我國野生大豆（G.soja）種質資源及其種質創新利用[J].中國農業科技導報，2000，2（6）：69-72.

[6] 王克晶，李向華.國家基因庫野生大豆（Glycine soja）資源最近十年考察與研究[J].植物遺傳資源學報，2012，13（4）：507-514.

[7] 朱倩，劉學義，謝颯英.野生大豆抗旱多態性研究[J].安徽農業科學，2015，43（32）：25-28.

[8] 肖鑫輝，李向華，劉洋，等.野生大豆（Glycine soja）耐高鹽堿土壤種質的鑒定與評價[J].植物遺傳資源學報，2009，10（3）：392-398.

[9] 楊振宇，本多健一郎，王曙明，等.中國東北抗蚜野生大豆重復鑒定的研究[J].吉林農業科學，2004，29（5）： 3-6.

[10] 馬曉萍，楊光宇，楊振宇，等.野生大豆在大豆育種中的應用[J].作物研究，2009，23（2）：11-12.

[11] YUAN C P，ZHOU G A，LI Y H，et al.Cloning and sequence diversity analysis of GmHs1pro-1 in Chinese domesticated and wild soybeans[J].Molecular breeding，2008，22（4）： 593-602.

[12] DIERS B W，ARELLI P R，CARLSON S R，et al.Registration of LDX01-1-65 soybean germplasm with soybean cyst nematode resistance derived from Glycine soja[J].Crop science，2005，45（4）： 1671-1672.

[13] HYTEN D L，SONG Q J，ZHU Y L，et al.Impacts of genetic bottlenecks on soybean genome diversity[J].Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America，2006，103（45）：16666-16671.

[14] KURODA Y，TOMOOKA N，KAGA A，et al.Genetic diversity of wild soybean （Glycine soja Sieb.et Zucc.） and Japanese cultivated soybeans[G.max（L.） Merr.] based on microsatellite （SSR）analysis and the selection of a core collection[J].Genetic resources and crop evolution，2009，56（8）：1045-1055.