硫代巴比妥酸法測定魚體肌肉中脂質過氧化物含量的方法優化

祁紅學 劉秀萍 安靜

摘要[目的] 優化魚體肌肉組織中脂質過氧化物（LPO）含量的測定條件。[方法] 使用硫代巴比妥酸分光光度法測定LPO含量，設計乙酸用量、十二烷基磺酸鈉（SDS）用量、處理時間和溫度4因素3水平的正交試驗，考察各因素水平組合對魚體肌肉中LPO含量測定的影響，優化測定條件。[結果]各因素對LPO含量測定結果的影響由大到小依次為SDS用量、乙酸用量、溫度、處理時間；通過直觀分析和方差分析，得出最優組合為A3B1C3D2 ，即測定的最優組合為20%的乙酸，65 ℃水浴中保持60 min。[結論]該研究可為魚類氧化應激損傷研究提供方法支持。

關鍵詞脂質過氧化；分光光度法；正交試驗

中圖分類號TS207.3文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）10-0091-02

Improvement of Thiobarbituric Acid Reaction for the Dertermination of Lipid Peroxidation in the Muscles of Fish

QI Hongxue，LIU Xiuping，AN Jing*（College of Chemistry and Chemical Engineering，Jinzhong University，Jinzhong，Shanxi 030619）

Abstract[Objective] To improve the optimum condition for measuring the lipid peroxidation （LPO） in the muscles of fish.[Method] The LPO was determined using spectrophotometer with thiobarbituric acid.The orthogonal design with four factors and three levels was conducted to evaluate the level of LPO in the cyprinoid fish.Four factors were included the gradient of acetic acid，sodium dodecyl sulfate，time and temperature，respectively.[Result] The weight sequence was known as SDS，the gradient of acetic acid，temperature，time by comparing the difference of each factor.The results indicated that the optimum group was A3B1C3D2 by visual analysis and variance analys，namely 20% acetic acid，65 ℃ water bath，60 min.[Conclusion] The study can support the research on the demage of oxidative stress in fish.

Key wordsLipid peroxidation；Spectrophotometry；Orthogonal test

細胞在發生氧化應激反應時，會發生脂質過氧化，該反應是發生于不飽和脂肪酸（UFA）共價鍵上的一系列自由基反應。機體內由于有很多UFA，因此極易受到氧化作用損傷，產生有細胞毒性的脂質過氧化物（LPO）[1]。

目前，對脂質過氧化的研究領域涵蓋了腫瘤、感染、衰老、心血管疾病、毒理學等方面[2-3]。測定脂質過氧化的方法有熒光和分光光度法[4]，由于分光光度法操作簡單、快速，仍在大量使用，其中硫代巴比妥酸（TBARS）法是最為常用的方法[5]。一些脂肪酸，尤其是不飽和脂肪酸，氧化后逐漸分解為一系列復雜的化合物（如醛和酮類化合物），稱之為TBARS反應物。通過檢測TBARS反應物的含量來反映LPO的水平，從而表征氧化應激反應對細胞膜的損傷水平[6]。有關此方法優化與改進的報道較多[7-8]，但鮮有專門針對魚體肌肉組織測定方法的報道，因此，有必要對其測定方法進行優化，以便適應魚體肌肉組織中LPO含量的測定。

筆者在Ohkawa等[5]的方法基礎上，加大三氯乙酸（TCA）的用量[9]，用甲醇代替正丁醇[8]，采用4因素3水平正交試驗對鯉魚肌肉組織液的LPO水平進行測定，4個因素分別為乙酸用量、十二烷基硫酸鈉（SDS）用量、處理時間和溫度。使用V-1200可見分光光度計測出鯉魚肌肉酶液的LPO吸光度值，再運用直觀分析法和方差分析對LPO的吸光度值進行分析，最終得到鯉魚肌肉組織中LPO含量的最佳測定條件。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及主要試劑。硫代巴比妥酸，分析純，北京化工廠；0.9%NaCl溶液，上海金穗生物科技有限公司；乙酸，分析純，北京化工廠；鯉魚，太原市萬柏林區市場；SDS，分析純，北京紅星化工科技公司。

1.1.2主要儀器設備。數顯恒溫水浴鍋（HH-6），常州智博瑞儀器制造有限公司；電子天平（WT3003），上海西艾愛電子有限公司；水浴氮吹儀（SHD-003），上海極恒實業有限公司；電動離心機（YXJ-1），江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；可見分光光度計（V-1200），上海美譜達儀器有限公司。

1.2試劑的配制

2%硫代巴比妥酸水溶液：用前加熱到70 ℃左右溶解。

10%和20%乙酸：用鹽酸調節pH為3.5。

2.5%和5.0% SDS水溶液：稱取2.5和5.0 g 的SDS，分別溶于100 mL 蒸餾水中，混勻后所得溶液就是2.5%和5.0% SDS工作液。

1.3鯉魚肌肉中LPO含量測定的正交試驗設計

選取的4個因素分別為乙酸用量、SDS用量、處理時間和溫度。4因素3水平L9（34）正交試驗設計如表1所示。

1.4酶液的制備

取出鯉魚肌肉組織一小塊，用電子天平稱重為3.553 g，加0.9% NaCl溶液5 mL，用研缽將肌肉研磨，直至得到鯉魚肌肉酶液。用移液器將鯉魚肌肉酶液轉移到5 mL試管，以3 000 r/min離心15 min，吸取上清液，待測。

1.5LPO含量的測定

每測定管加入0.3 mL酶液、0.1 mL SDS、0.3 mL乙酸、0.2 mL 2%硫代巴比妥酸溶液。分別在18、65和95 ℃下反應，于20、35和60 min時取出相應測定管，加入1.0 mL 甲醇，充分混勻后離心，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，用分光光度計在波長535 nm處測其吸光度值。

2結果與分析

2.1正交試驗結果的直觀分析

鯉魚肌肉中LPO含量測定的正交試驗結果見表2。

對各因素的極差進行比較，可知RB>RA>RD>RC，得出各因素對測定結果的影響由大到小依次為SDS用量、乙酸用量、溫度、處理時間。可以看出，SDS和乙酸的用量對LPO含量測定的影響占主要因素，反應溫度和時間的影響次之。

通過每個試驗因子的均值可以看出，A3B1C3D2為測定鯉魚肌肉組織中LPO含量的最佳方案，即為正交試驗中的7號處理組合，也是9個處理組合中吸光度值最高者，但與其他處理有無統計學差異，還需進行方差分析。

2.2正交試驗結果的方差分析方差分析結果顯示，FA=10.9，FB=23.3，FC=1.0，FD=5.6，F0.05=19.0，F0.01=99.0。可以看出，只有因素B的F值達到顯著水平（P<0.05），即SDS的用量對LPO含量的影響最為顯著，其他因素的影響均不顯著。這與文獻[5]報道的方法有所不同，主要區別在于SDS的含量，文獻報道可加入5.0%的SDS，以除去蛋白質的干擾，而此次正交試驗的結果顯示，其對LPO含量的測定具有一定的干擾，SDS在不加入時效果最為明顯，在加入2.5%和5.0%時達不到最佳測定條件，作用不但不明顯，反而具有干擾作用，因此以不用為宜。

3結論

近年來，藥物中間體、殺蟲劑等環境污染物逐漸威脅水生生物安全，研究水體生物的氧化應激，可評價污染物的毒性，為疾病的早期診斷、預防和治療提供科學依據。該研究通過設計4因素3水平的正交試驗，確定了魚體肌肉中LPO含量測定的最佳條件為20%的乙酸，反應時間60 min，反應溫度65 ℃。該方法操作簡單、快速、穩定，可較好地測定魚體肌肉組織中LPO含量，為魚類氧化應激評定提供了依據，有望用于毒性物質或未知物對魚類造成的氧化應激損傷機理的研究。

參考文獻

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