蕨菜孢子無菌繁殖研究

吳春華 王淼 王媚 孫麗娜 石元亮

摘要[目的] 探討蕨菜孢子無菌繁殖的最佳培養(yǎng)方法。[方法] 以蕨菜孢子為材料，研究消毒方式、赤霉素（GA3）濃度、光照和溫度、無機鹽和糖濃度對孢子萌發(fā)、原葉體發(fā)育、原葉體增殖、幼孢子體誘導的影響。[結(jié)果] 5%NaClO溶液消毒5 min為蕨菜孢子最佳消毒方式；在含有0.2 mg/L GA3的培養(yǎng)基上，孢子萌發(fā)速度明顯提高，比CK提前13 d，心形原葉體出現(xiàn)時間也提前10 d；MS是蕨菜孢子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基，蕨菜孢子萌發(fā)溫度最好在20～25 ℃，心形原葉體必須在光照條件下才能形成；蕨菜原葉體增殖最適培養(yǎng)基是MS，此時增殖系數(shù)達79.1；蕨菜原葉體增殖培養(yǎng)基最適糖濃度為1%，此時增殖系數(shù)是88.3；KT激素有利于蕨菜孢子體形成，最佳培養(yǎng)基為MS+ KT 0.2 mg/L，葉片最多（4.6個），孢子體出現(xiàn)時間最短（35 d）。[結(jié)論] 該研究結(jié)果可為蕨菜產(chǎn)業(yè)化快繁體系建立提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞蕨菜；孢子；培養(yǎng)方法

中圖分類號S647；Q945.51文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）12-0118-04

Abstract[Objective] To explore the best cultural method of sterile propagation of Pteridium aquilinum spores. [Method] Effects of disinfection way，GA3 concentration，illumination，temperature， inorganic salt and sucrose concentration on P. aquilinum spore germination， prothallus growth， prothallus proliferation and young sporophytes induction were studied.[Result] The best disinfection way of P. aquilinum spores was 5%NaClO for 5 mins. In the medium containing 0.2 mg/L of GA3， the spores germinated significantly faster，which was 13 days earlier than control group， the heartshaped prothallus appeared 10 days in advance. MS was the best medium for germination of P.aquilinum spores. The optimal temperature range for germination was 20～25 ℃， and heartshaped prothallus formed only in adequate light. The most suitable concentration of inorganic salt and sucrose for multiplication medium of P. aquilinum prothallus were MS and 1%， in which the proliferation coefficients were 79.1 and 88.3 respectively. Hormone KT was beneficial for forming the spores of P. aquilinum and its optimal concentration for medium was MS+ KT 0.2 mg/L， in which the number of leaves was up to 4.6， and spores first appeared on the 35th day after inoculation.[Conclusion]This results provide a theoretical basis for industrial rapid propagation system of P. aquilinum.

Key wordsPteridium aquilinum；Spores；Cultural method

蕨類植物是古老的維管植物，也是植物界系統(tǒng)演化中一個獨特的自然類群，其生活史有配子體和孢子體[1-2]。孢子繁殖是蕨類植物進行自我繁衍和發(fā)展進化的最主要途徑[3]。蕨菜[Pteridium aquilinum（ L.）Kuhn]是鳳尾蕨科（Pteridaceae）多年生草本植物，別名蕨、如意菜、龍頭菜、蕨薹，是醫(yī)食兩用的林下野生蔬菜[4-5]。蕨菜以未展開的幼葉和幼嫩葉柄供食，營養(yǎng)豐富，清香適口，是廣大群眾喜食的一種山野菜[6]。該研究通過無菌繁殖技術(shù)篩選出蕨菜孢子的最佳培養(yǎng)條件，培育成蕨菜種苗，為蕨菜大棚栽培大量繁殖和開發(fā)利用提供充足的種苗，同時進行蕨菜深加工，實現(xiàn)蕨菜的經(jīng)濟價值，也為農(nóng)民提供一條致富道路。

1材料與方法

1.1材料蕨菜孢子成熟期，采集葉片帶有成熟孢子的羽片，平鋪在報紙上陰干，一般在3 d葉片干燥后，用手輕輕撥動報紙上的干燥羽片，使絕大部分的孢子和孢子囊都散落在報紙上，將其裝入干凈硫酸紙袋內(nèi)備用。

1.2方法

1.2.1消毒方式對孢子萌發(fā)和原葉體生長的影響。取成熟的孢子，在蒸餾水中浸泡12～24 h，裝于1.5 mL離心管中。設(shè)置2種消毒劑：①5%NaClO溶液，消毒時間分別為3.0、5.0和7.0 min；②0.1% HgCl2溶液，消毒時間為1.5、2.5和3.5 min。將加入消毒劑的離心管充分振蕩，放于2 000 r/min離心機中離心3～5 min，棄上清液，無菌水沖洗4～5遍后離心，加入7.5 mL的無菌水，移液槍取0.75 mL均勻接種在MS培養(yǎng)基表面，每處理各接種10瓶。培養(yǎng)室溫度為（25±2）℃；熒光燈光源，每天光照10 h，光照強度1 500～2 000 lx。調(diào)查項目為污染率、孢子萌發(fā)時間、原葉體生長狀態(tài)。

1.2.2

赤霉素（GA3）濃度對孢子萌發(fā)的影響。以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分4個水平加入GA3：0（CK）、0.1、0.2、0.4 mg/L，觀察孢子萌發(fā)時間，每處理各接種10瓶，培養(yǎng)條件同“1.2.1”。調(diào)查項目為孢子萌發(fā)時間、心形原葉體出現(xiàn)時間。

1.2.3

培養(yǎng)基對孢子萌發(fā)和原葉體生長的影響。培養(yǎng)基采用Knops，MS，1/2MS、1/4MS（大量和微量元素為MS培養(yǎng)基全量的1/2、1/4，鐵鹽和有機物含量與MS培養(yǎng)基相同），pH 5.8，瓊脂6.8 g/L。培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min。孢子用5%NaClO溶液消毒5 min，待培養(yǎng)基冷卻后將無菌孢子懸濁液均勻接種（每個瓶中接種0.75 mL），每處理各接種10瓶。輕微晃動培養(yǎng)瓶使孢子均勻散開，培養(yǎng)條件同“1.2.1”。調(diào)查項目為孢子萌發(fā)時間、心形原葉體出現(xiàn)時間、原葉體量。

1.2.4

光照和溫度對孢子萌發(fā)的影響。以MS為基本培養(yǎng)基，將經(jīng)過0.2 mg/L 濃度GA3處理的孢子分別進行光培養(yǎng)（培養(yǎng)條件同“1.2.1”）和暗培養(yǎng)（無光照），每種光照處理培養(yǎng)溫度又設(shè)為15、20、25、30 ℃，每處理各接種10瓶。調(diào)查項目為孢子萌發(fā)時間、心形原葉體出現(xiàn)時間、原葉體顏色。

1.2.5

無機鹽濃度對原葉體增殖的影響。為篩選出原葉體增殖最適合的無機鹽濃度，采用MS、1/2MS、1/4MS、1/8MS共4種培養(yǎng)基（所有培養(yǎng)基均含3%蔗糖，pH 5.8，瓊脂6.0 g/L）對原葉體進行增殖培養(yǎng)，每處理各接種10瓶，培養(yǎng)條件同“1.2.1”。調(diào)查項目為原葉體顏色、原葉體長勢、增殖系數(shù)（增殖系數(shù)=增殖后的原葉體鮮重/接種時的鮮重）。

1.2.6

糖濃度對原葉體增殖的影響。以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，調(diào)查不同蔗糖濃度（0、1%、3%、5%、7%）對蕨菜原葉體增殖的影響，每處理各接種10瓶，培養(yǎng)條件同“1.2.1”。調(diào)查項目為原葉體顏色、原葉體長勢、增殖系數(shù)（增殖系數(shù)=增殖后的原葉體鮮重/接種時的鮮重）。

1.2.7

幼孢子體的誘導。將原葉體接種于含0、0.1、0.2、0.5 mg/L激動素（KT）的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基表面保持有水滴（利于受精），每處理各接種10瓶。調(diào)查項目為幼孢子體出現(xiàn)時間、幼孢子體數(shù)、葉片數(shù)、幼孢子體長勢。

2結(jié)果與分析

2.1消毒方式對孢子萌發(fā)和原葉體生長的影響

由表1可知，采用5%NaClO溶液消毒5.0 min的孢子消毒效果較好，40 d左右就能萌發(fā)，培養(yǎng)基上均見到少量孢子發(fā)育出綠色小點（圖1），進一步培養(yǎng)60 d見到對稱心形原葉體（圖2），90 d后原葉體逐漸成熟，成熟的原葉體邊緣及背腹面著生較多的毛狀體（圖3）。采用HgCl2溶液消毒能明顯降低污染率，但HgCl2穿透性強，影響蕨菜孢子的萌發(fā)，且隨著消毒時間延長，配子體發(fā)育緩慢，甚至不能形成片狀體。故5%NaClO溶液消毒5 min為孢子最佳消毒方式。

2.2GA3濃度對孢子萌發(fā)的影響

從表2可以看出，GA3對蕨菜孢子萌發(fā)有促進作用，其中以0.2 mg/L GA3效果明顯，在含有0.2 mg/L GA3的培養(yǎng)基上，孢子萌發(fā)速度明顯提高，比CK提前13 d，心形原葉體出現(xiàn)時間也提前10 d。

2.3培養(yǎng)基對孢子萌發(fā)和原葉體生長的影響

由表3可知，4種培養(yǎng)基上的孢子在接種后均可萌發(fā)，MS和Knops培養(yǎng)基中的孢子經(jīng)33～34 d萌發(fā)，比其他培養(yǎng)基早3～5 d，且萌發(fā)后原葉體生長發(fā)育較快。MS培養(yǎng)基上原葉體鮮重最大，在配子體發(fā)育階段，低無機鹽濃度培養(yǎng)基中配子體呈黃綠色且萌發(fā)量也少，生長發(fā)育緩慢，不利于孢子體苗的形成。綜合孢子萌發(fā)量和原葉體生長情況來看，MS是蕨菜孢子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基。

2.4光照和溫度對孢子萌發(fā)的影響

從表4可以看出，光照對蕨菜孢子的萌發(fā)影響不大，但對心形原葉體的形成影響甚大，在沒有光照條件下心形原葉體是不能形成的。在15～30 ℃范圍內(nèi)，隨溫度的升高，孢子萌發(fā)時間和心形原葉體出現(xiàn)時間也縮短，但低溫（15 ℃）和高溫（30 ℃）時原葉體顏色是黃綠，只有20 ℃和25 ℃范圍生長的原葉體顏色是翠綠。因此，蕨菜孢子萌發(fā)溫度最好在20～25 ℃，心形原葉體必須在光照條件下才能形成。

2.5無機鹽濃度對原葉體增殖的影響

由表5可知，培養(yǎng)基中大量元素濃度對蕨菜配子體的增殖有很大的影響。1/2MS培養(yǎng)基中原葉體的增殖總量比MS的少，1/4MS培養(yǎng)基上原葉體有明顯的營養(yǎng)不良傾向，原葉體增殖后呈黃綠色，長勢差，而在1/8MS培養(yǎng)基上，原葉體生長一段時間后即死亡。蕨菜原葉體增殖最好的培養(yǎng)基是MS（圖4），此時增殖系數(shù)達79.1。

2.6糖濃度對原葉體增殖的影響

由表6可知，培養(yǎng)基中糖濃度對蕨菜原葉體增殖有很大影響。其中，MS+1%蔗糖培養(yǎng)基上的原葉體增殖系數(shù)最大（88.3），蔗糖濃度超過或低于1%，均不利于原葉體的增殖及生長。蕨菜原葉體增殖最佳培養(yǎng)基為MS+1%蔗糖，此時增殖系數(shù)是88.3。

2.7幼孢子體的誘導

從表7可以看出，在MS培養(yǎng)基中幼孢子體沒有形成，表明KT對幼孢子體的形成非常重要。在含有KT的MS培養(yǎng)基中均出現(xiàn)幼孢子體，其中MS+KT 0.2 mg/L培養(yǎng)基上的幼孢子體葉片最多（4.6個），長勢最好（圖5），幼孢子體出現(xiàn)時間最短（35 d），說明適宜濃度的KT有利于幼孢子體的形成。

2.8幼孢子體生根誘導及移栽

組培方式誘導出的幼孢子體需要進行生根誘導，取無根孢子體，接種在含0.5 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上，約20 d，形成完整的蕨菜植株。待孢子體長至4 cm左右，根系2～3 cm長時，進行煉苗移栽。移栽基質(zhì)為50%草炭+50%細河沙，灑水保持濕潤。

3結(jié)論

（1）5%NaClO溶液消毒5 min為蕨菜孢子最佳消毒方式；在含有0.2 mg/L GA3的培養(yǎng)基上，孢子萌發(fā)速度明顯提高，比CK提前13 d，心形原葉體出現(xiàn)時間也提前10 d；MS是蕨菜孢子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基。

（2）蕨菜孢子萌發(fā)溫度最好在20～25 ℃，心形原葉體必須在光照條件下才能形成。

（3）蕨菜原葉體增殖最好的培養(yǎng)基是MS，此時增殖系數(shù)達79.1；蕨菜原葉體增殖最佳培養(yǎng)基為MS+1%蔗糖，此時增殖系數(shù)是88.3。

（4）KT有利于蕨菜幼孢子體形成，最佳培養(yǎng)基添加濃度為MS+ KT 0.2 mg/L，此時蕨菜葉片最多（達4.6個），長勢最好，幼孢子體出現(xiàn)時間最短（35 d）。

參考文獻

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