山羊體細胞重編程過程中慢病毒對細胞的毒性作用

宋輝 李卉 王鋒

摘要[目的] 檢測慢病毒對普通山羊、克隆奶山羊和轉基因克隆奶山羊的作用。[方法] 采用慢病毒作為載體感染普通山羊、克隆奶山羊（♂12001）和轉基因克隆奶山羊（♀12003）體細胞，通過細胞生長曲線，檢測慢病毒對3種山羊細胞的毒性作用。[結果] 感染后的3種體細胞在感染前3 d，細胞大量凋亡，4～7 d篩選出的細胞大量增殖。未經慢病毒感染的3種細胞接種2 d后數量開始明顯增加，第2～5天進入對數生長期，第5～7天進入平臺期，呈現典型的“潛伏期-對數生長期-停滯期”生長模式。[結論] 慢病毒對細胞有毒性作用，會引起細胞大量凋亡。

關鍵詞慢病毒；細胞生長曲線；凋亡

中圖分類號S858.27文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）35-0082-03

Abstract[Objective]The aim is to detect the role of lentivirus in normal goats， cloned dairy goats and transgenic cloned dairy goats. [Methods] Using lentiviral vector infection as a common goat， cloned goats （male 12001） and transgenic cloned goats （female 12003） somatic cells by cell growth curve， toxic effect of lentivirus on three kinds of goat cell was detected . [Result]After infection， the three somatic cells were infected with 3 days， and the apoptosis of cells was large. The cells screened from 4 d to 7d proliferated greatly. Without the lentivirus infected three cells significantly increased after inoculation with 2 d， cells entered the logarithmic growth phase from 2rd day to 5th day， then entered the platform phase from 5th day to 7th day， it was a typical “latencylogarithmic growth period - the period of stagnation” growth mode. [Conclusion] Lentivirus plays a toxic role in cells and can cause apoptosis in a large number of cells.

Key wordsLentivirus；Cell growth curve；Apoptosis

目前，常用的病毒載體主要包括腺病毒、逆轉錄病毒和慢病毒3類[1]。腺病毒具有宿主范圍廣、致病性低、不會整合到宿主基因組等優點，但是轉染效率低。逆轉錄病毒的轉染效率比腺病毒高，但是只能轉染分裂期的細胞。慢病毒是逆轉錄病毒的一種，不但可以轉染分裂期的細胞，還可以轉染非分裂期的細胞，大大提高了轉染效率，但是不論是逆轉錄病毒還是慢病毒都面臨著一個問題：宿主細胞毒性[1-3]。

誘導性多能干細胞（ Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs）是由分化的體細胞通過轉入特定基因誘導體細胞重編程成為多能干細胞，避免了胚胎干細胞面臨的倫理困境和免疫排斥等問題，給干細胞研究領域帶來革命性的變化[4-6]。在試驗過程中，為了獲得高轉染效率，很多試驗人員選擇慢病毒載體，但是慢病毒對宿主細胞的毒害作用鮮有報道。細胞生長曲線是測定細胞絕對增長數值的常用方法，也是檢測細胞活力的重要指標。因此，取地方品種山羊、克隆奶山羊和轉基因克隆奶山羊未感染的第3代處于對數生長期的細胞及對應的病毒感染后的細胞，以培養時間為橫坐標，細胞密度為縱坐標繪制生長曲線，從而檢測體細胞重編程過程中慢病毒對細胞的作用。

1材料與方法

1.1主要試劑

DMEM培養基、DMEM/F12培養基、胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸、雙抗、無鈣鎂PBS緩沖液、胰蛋白酶、谷氨酰胺、β-巰基乙醇均購置于美國Life公司。

1.2方法

1.2.1質粒的轉化。將TOP10感受態細胞從-80 ℃冰箱取出，在冰上融化。將5 μL高濃度GOF-18質粒加入感受態細胞中，輕晃混勻，冰上放置30 min。42 ℃熱休克90 s，不要搖動試管。快速轉移至冰浴中，冷卻2 min。加500 μL無抗生素的普通LB培養基，37 ℃，150 r/min復蘇45 min。用無菌接種棒將200 μL菌液鋪于含抗生素的平板上，37 ℃正置20 min。倒置平板，37 ℃培養12～16 h，4 ℃保存。

1.2.2質粒小量制備提取（試劑盒抽提法）。按Omega質粒小提試劑盒操作手冊抽提質粒，步驟如下：取菌液5～10 mL，室溫12 000 r/min離心2 min，棄上清。加入250 μL Buffer S1，渦旋。加入250 μL Buffer S2，上下翻轉5～7次。加入350 μL Buffer S3，上下翻轉數次，室溫靜置2 min。12 000 r/min，離心10 min。吸取700 μL上清液到吸附柱中，11 000 r/min，離心1 min。加500 μL Buffer HD，離心同上。加700 μL Wash Buffer，離心同上。重復上面的步驟一次。倒去上清液，空離1次，12 500 r/min，離心3 min。取出柱子，放到無菌1.5 mL離心管中，向柱子中央加入65 ℃預熱的Eluent Buffer 80 μL，室溫靜置2 min，12 500 r/min，離心2 min。用紫外分光光度計測定質粒的濃度和純度。

1.2.3細胞復蘇、傳代和凍存。將凍存細胞從液氮罐里取出，投入到37 ℃恒溫水浴鍋中，迅速解凍，接種到培養瓶中。當細胞匯合到80%以上，用胰酶進行消化傳代，多余的細胞加凍存液放到凍存管里，依次放到4 ℃冰箱里30 min，-20 ℃冰箱1～2 h，-80 ℃冰箱過夜，最后放到液氮里長期保存。山羊成纖維細胞使用F3代細胞，293FT細胞解凍后，傳代2～3次，調整好細胞狀態進行病毒包裝。

1.2.4慢病毒包裝。將293FT細胞傳至T75的培養瓶中，細胞貼壁后換為無抗生素培養基培養至細胞匯合度達80%～90%。 準備5個10 mL離心管，前4個加1.5 mL OPTI-MEM，最后一個加6 mL，依次編號①、②、③、④、⑤。將脂質體LIPFACTIN 2000輕輕搖一搖，⑤號管中先吸出260 μL OPTI-MEM，再加260 μL（65ULX4）脂質體，上下倒置混勻。向①、②、③、④號管中加包裝載體PAPX：8 μg，PMD：4 μg，并且分別加4種因子12 μg，用手指輕叩管底，混勻，室溫放置5 min。將離心管⑤號管中的溶液分別向①、②、③、④號管各加1.5 mL，用手指輕叩管底，記時20 min到4 h。293FT細胞每個瓶子上標號，①、②、③、④號離心管補加到10 mL，將293FT細胞中的培養液吸出，換成4個離心管中的溶液。8～11 h后換成體細胞培養液。轉染后48 h和72 h分別收集病毒，然后用0.45 μm濾器過濾后，超低溫離心機4 000 r/min，4 ℃，離心30 min，進行病毒濃縮，分裝后凍于-80 ℃冰箱。

1.2.5包裝病毒質量的檢測。在24孔板的9個孔中鋪293FT細胞，編號①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨。當細胞密度達70%～80%的匯合度時，每個孔加0.5 mL培養液，在①、②、③、④孔中分別加適量的4種病毒濃縮液：OCT4、SOX2、KLF4和CMYC，在⑤、⑥、⑦、⑧孔中分別加適量的4種病毒原液：OCT4、SOX2、KLF4和CMYC，第⑨個孔什么都不加。40 h后在熒光顯微鏡下觀察熒光表達。

1.2.6細胞生長曲線繪制。用胰酶消化羊耳成纖維細胞，用含有病毒感染液的培養液將細胞吹成單細胞懸液，接種到培養板上。取地方品種山羊、克隆奶山羊和轉基因克隆奶山羊未感染的第3代處于對數生長期的細胞和對應的病毒感染后的細胞，接種于24孔培養板中，按1×104個/mL的密度，每孔接種1 mL。接種時記為0小時，每隔24 h對3孔內的細胞密度進行計數，計算平均值，一共計數7 d。以培養時間為橫坐標，細胞密度為縱坐標繪制生長曲線。

2結果與分析

2.1病毒質量檢測

病毒感染40 h后，在熒光顯微鏡下可以觀察到293FT細胞帶有紅色熒光（圖1），說明包裝的病毒質量很好，而且濃縮病毒感染后的293FT細胞的熒光強度要強于病毒原液感染后293FT細胞的熒光強度。

2.2誘導前后細胞變化特征

3種細胞接種2 d后數量明顯增加，第2～5天進入對數生長期，第5～7天進入平臺期，呈現典型的“潛伏期-對數生長期-停滯期”生長模式（圖2、3、4）。而感染后的3種體細胞在感染前3 d，細胞大量凋亡（圖5A）。4～7 d篩選出的細胞大量增殖（圖5B）。

3結論與討論

實驗室已經成功地批量生產轉基因克隆奶山羊，通過檢測發現，轉基因hLF已經很好地整合到這些克隆羊的基因組中[7]。取地方品種山羊、克隆奶山羊和轉基因克隆奶山羊未感染的第3代處于對數生長期的細胞及對應的病毒感染后的細胞，以培養時間為橫坐標，細胞密度為縱坐標繪制生長曲線。3種細胞接種2 d后數量開始明顯增加，第2～5天進入對數生長期，第5～7天進入平臺期，呈現典型的“潛伏期-對數生長期-停滯期”生長模式。而感染后的3種體細胞在感染前3 d，由于病毒的侵染，引起了細胞免疫應答，相關基因的表達，外源 dsRNA和多肽引起細胞凋亡，氧化還原，DNA重置和抗原反應。由于病毒侵入引起的這些突出的

生物學過程還伴隨著細胞凋亡，0～4 d細胞增殖速度加快，但是伴隨有大量的誘導凋亡的過程。這個時間段的作用可能是使外源轉錄因子融入細胞，并篩選更加強壯的病毒感染后的細胞，4～7 d篩選出的細胞大量增殖。

參考文獻

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