木薯再生體系建立的研究進展

文峰 蘇文潘 黃建祺 鄭華 俞奔馳 付海天

摘要木薯是一種重要的糧食和工業原料作物。隨著細胞工程和基因工程的發展，生物技術育種要求一種高效的再生體系。從木薯的器官發生途徑、體細胞胚發生途徑、脆性胚性愈傷組織（FEC）再生和原生質體再生4個方面闡述了木薯再生體系的發展與建立，以期為木薯組織培養和基于木薯再生體系的技術進步提供參考。

關鍵詞木薯；器官發生；體細胞胚發生；脆性胚性愈傷組織（FEC）；原生質體；再生

中圖分類號S533文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）08-0156-03

Research Progress of Establishment of Regeneration System in Cassava

WEN Feng1，2，SU Wenpan1，HUANG Jianqi1 et al（1.Guangxi Institute of Subtropical Crops，Nanning，Guangxi 530001；2.Huazhong Agricultural University，Key Laboratory of Horticultural Plant Biology （Ministry of Education），Wuhan，Hubei 430070）

AbstractCassava is an important crop for food and industrial raw materials.With the development of cell engineering and gene engineering，highly efficient regeneration system is a prerequisite for biotechnology breeding.This review summarizes the development and establishment of regeneration of cassava，via organogenesis，somatic embryogenesis，friable embryogenic callus （FEC） and protoplast，hoping to provide some useful reference for the technical progress of tissue culture and regeneration system of cassava.

Key wordsCassava；Organogenesis；Somatic embryogenesis；Friable embryogenic callus （FEC）；Protoplast；Regeneration

木薯（Manihot esculenta Crantz）別名樹薯，屬于大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot）多年生灌木，常作為一年生作物栽培，因其塊根富含淀粉，被譽為“淀粉之王”。木薯在熱帶、亞熱帶地區是重要的糧食作物，還是生產淀粉、變性淀粉、酒精、葡萄糖等工業產品的重要原料，被用于食品、化工、醫藥、紡織、造紙等多種行業，其塊根、嫩莖、枝葉也常用作飼料。

木薯遺傳背景復雜，具有基因型高度雜合、花粉育性低、種子萌發率低和有性子代性狀嚴重分離[1-2]的特性，使其傳統育種受到一定限制。生物技術育種是傳統育種方法的一種補充手段。隨著細胞工程和基因工程的發展，生物技術育種要求一種高效的再生體系。木薯的組織培養技術起步較晚，但在國際熱帶農業中心（International Center for Tropical Agriculture，CIAT）得到發展，主要用于脫毒、無性繁殖、種質收集保存和種質交換。木薯種子顯示了高度的基因多樣性，有性繁殖會導致基因嚴重分離，因此作為無性繁殖作物，從特定的組織再生植株顯得尤為重要。木薯科研工作者也一直在朝著這個方向努力。目前，木薯已經建立的再生體系主要有器官發生途徑、體細胞胚發生途徑、脆性胚性愈傷（FEC）再生和原生質體再生4種。筆者對木薯現有的4種再生體系發展與建立進行了總結與歸納，以期為木薯組織培養和基于木薯再生體系的技術進步提供一些參考。

1器官發生途徑

1974年，Kartha等[3]首次對木薯的頂端分生組織進行了培養，獲得5個品種的完整植株。1994年，Konan等[1]用高濃度的細胞分裂素6-BA（10 mg/L）培養木薯腋芽，形成了致密的類似球莖的結構，然后轉移到低濃度的6-BA培養基上，能形成多莖結構，再生了植株。

在建立體細胞胚發生的基礎上，初生胚胎、次生胚胎以及循環胚胎形成的子葉都可在含1.0 mg/L 6-BA 和 0.5 mg/L IBA的培養基中經器官發生再生植株[4]。初生胚胎的子葉器官發生的能力較低，循環胚胎子葉器官發生能力最高[5]。木薯器官發生途徑可來源于腋芽、莖尖、嫩葉以及初生胚、次生胚、循環胚的子葉等外植體。

2體細胞胚發生途徑

2.1體細胞胚發生的發展

自1982年Stamp等[6]首次報道以木薯合子胚的胚軸和子葉為外植體成功誘導出胚狀體以來，該方法現已得到普遍發展。從最初的2步：①在包含2，4-D的培養基中誘導體細胞胚胎；②將誘導的胚狀體轉到含2，4-D、6-BA、含或不含GA的培養基中發展莖，之后再生根[7-8]，細化到現在的4步：①在包含2，4-D等生長素的培養基中誘導體細胞胚胎；②在含低濃度6-BA的培養基中成熟或萌發；③在含高濃度6-BA的培養基中生長，發展成莖；④在含低濃度NAA或不含激素的培養基中生根[9-11]。循環①、②步，能產生次生胚胎和循環胚胎，形成循環的體細胞胚發生體系，循環的胚胎外植體誘導胚胎更顯著[9，11]。此后的相關體細胞胚發生研究也大多在此基礎上，根據基因型、外植體類型及激素類型等不同因素進行了優化。所用外植體也從最開始的合子胚的胚軸和子葉發展到莖尖、嫩葉、腋芽、花組織以及初生胚、次生胚、循環胚的子葉。

2.2植物激素對體細胞胚發生的影響

植物激素在木薯體細胞胚發生中有重要作用。2，4-D、Picloram和NAA常作為誘導木薯體細胞胚發生的激素，但根據木薯品種、外植體類型的不同，誘導的能力也有所不同。2，4-D濃度在 1～8 mg/L范圍內增加時，體細胞胚胎誘導率顯著增加；當濃度在 8～16 mg/L時，胚胎誘導率是相似的[8]。研究顯示，在某些基因型中，誘導初生胚胎，Picloram比2，4-D效果更好[12-13]。起初的研究認為NAA沒有誘導初生胚胎的能力，但有誘導次生胚胎的能力[14]。馬國華等[15]研究顯示，采用高濃度的NAA，能成功地直接誘導初生體細胞胚發生和芽的形成。后來的研究也證實了這一結果[16]。盡管研究的激素較多，但目前常采用12 mg/L 的Picloram誘導常規木薯的體細胞胚發生。

有研究認為在體細胞胚胎誘導早期，生長素起關鍵作用，而6-BA有抑制作用，一旦胚胎形成后，生長素抑制莖結構形成，而6-BA促進莖結構形成。同時認為，改變生長激素能調控木薯經體細胞胚發生途徑或器官發生途徑再生。外植體在含生長素的培養基上培養，一旦胚性細胞團被誘導，若繼續在此培養基上培養，則向體細胞胚發生途徑發展，若轉入含6-BA的培養基上培養，則向器官發生途徑發展，而誘導時間決定了胚性細胞團的誘導。在含生長素的誘導培養基上培養的時間越長，越多的胚性細胞團發展成胚胎，也越難改變再生路徑[17]。

3脆性胚性愈傷組織（FEC）誘導與再生

在植物中，FEC已經得到發展，合子胚通常是用于誘導的首選外植體材料[18]。在木薯中，合子胚基因型嚴重分離，不清楚基因型來源，不適合作為外植體，如同體細胞胚發生一樣。

Taylor等[19]描述FEC發生于嫩葉誘導初生胚胎，經次生胚胎或循環胚胎發生，將高質量的胚性組織在含Picloram的GD培養基上連續繼代培養，產生一種由數十個細胞組成的直徑約1 mm的細小細胞團結構，即脆性胚性愈傷組織。這種結構新陳代謝快，分離出來后，在SH液體培養基中懸浮培養可迅速擴增。嫩葉誘導初生胚胎的胚性組織質量不高，次生胚胎或循環胚胎培養產生的胚性組織質量較高。

FEC的誘導仍存在基因型限制。Taylor等[20]在20個木薯供試品種中，成功誘導了14個品種的FEC，并且FEC產生的時間和植株的再生效率存在很大差異。Raemakers等[21]報道，供試的10個木薯基因型中只有6個獲得了FEC，每個基因型的FEC都能再生植株，但再生的效率不同。方佳敏等[22]對11個主栽木薯品種進行誘導FEC，經多次重復的誘導與條件優化，結果表明只有4個木薯品種在GD培養基上多次繼代培養后，可獲得FEC。盡管木薯的FEC難誘導，但一旦誘導了FEC，均能再生成植株。FEC的再生過程與體細胞胚發生再生過程類似，除起始材料不同外，都經過誘導胚胎出現、胚胎成熟、莖伸長、生根4個階段。

4原生質體培養與再生

4.1葉肉原生質體的培養與再生

木薯葉片分離原生質體再生植株僅有1例成功的報道[23]，其他學者不能重復這個過程[24-25]。Anthony等[24]采用組培苗的葉片分離原生質體，用固（B5培養基）液（無銨MS培養基）雙層法培養，并在培養基中均勻垂直地插入短玻璃棒，對照不插玻璃棒，其他均相同，結果原生質體只在插玻璃棒的培養基中持續分裂，形成肉眼可見的愈傷，但仍沒有再生植株。此后再未見木薯葉肉原生質體培養的相關報道，后人一般認為木薯葉肉原生質體不能再生植株。

4.2胚性愈傷組織原生質體的培養與再生

20世紀90年代，木薯原生質體再生研究取得了突破性的進展。在建立FEC及其懸浮系的基礎上[19]，展開了木薯品種TMS60444原生質體分離、純化及培養研究，并再生了植株，然而再生效率低，主要是由于原生質體起源的愈傷組織分化體細胞胚的效率低，并且成熟胚萌發效率也低造成的，這成為木薯原生質體再生植株的瓶頸[25]。2012 年，筆者根據前人[25]的研究基礎，分離木薯品種TMS60444的FEC懸浮系原生質體并培養，在胚狀體發生過程中采用MSN培養基培養，對前人提及的瓶頸問題有所改進，原生質體再生效率有較大提高，建立了相對完整有效的木薯脆性愈傷原生質體再生體系[26]。目前原生質體再生成功的經驗是先誘導胚性愈傷組織，再建立胚性懸浮系，利用胚性懸浮系分離原生質體，這樣分離的原生質體容易再生。該方法已在水稻[27]、玉米[28]、甘蔗[29]、小麥[30]等多種作物的原生質體再生過程中成功應用。

5結語

木薯是一種主要糧食作物，對其再生體系的研究落后于水稻、小麥等糧食作物。直到20世紀90年代木薯的再生體系研究才得到了充分發展，從器官發生、體細胞胚發生、FEC再生，再到原生質體再生，都有了新的突破。當時木薯的體細胞胚發生是一個研究熱點，無論是品種、外植體類型，還是激素影響的研究都非常多[7-17]。這些促使了遺傳轉化技術的進步，為木薯遺傳轉化的發展奠定了基礎。

目前木薯再生體系的應用除種質保存、無性繁殖外，主要應用于遺傳轉化。子葉和FEC常作為遺傳轉化的起始材料。木薯遺傳轉化有2種方式：一種是利用體細胞胚發生得到的子葉，經過器官發生得到轉基因植株；另一種是利用FEC再生得到轉基因植株。器官發生應用于遺傳轉化研究，其優點是基因型不受限制，再生時間短，簡單、易操作，缺點是再生效率低，有假陽性和嵌合現象。FEC是很多基礎研究的重要起始材料，是木薯高效遺傳轉化的最合適材料[31]。FEC再生應用于遺傳轉化研究，其優點是轉化效率高，可以得到較多的轉基因植株，缺點是受基因型限制，有嵌合現象，FEC在繼代保存及再生過程中可能發生體細胞變異。目前遺傳轉化的研究報道大多是模式品種TMS60444、M.Col 22，轉換到栽培種中還需要優化。木薯原生質體再生，其操作過程繁瑣，技術要求較高，再生成功的報道少。若在原生質體再生的基礎上原生質體融合及原生質體轉化等研究成功，將為木薯育種提供一條新途徑。

參考文獻

[1]

KONAN N K，SANGWAN R S，SANGWANNORREEL B S.Efficient in vitro shootregeneration systems in cassava （Manihot esculenta Crantz）[J].Plant breeding，1994，113（3）：227-236.

[2] MUSSIO I，CHAPUT M H，SERRAF I，et al.Adventitious shoot regeneration from leaf explants of an African clone of cassava（Manihot esculenta Crantz） and analysis of the conformity of regenerated plants[J].Plant cell，tissue and organ culture，1998，53（31）：205-211.

[3] KARTHA K K，GAMBORG O L，CONSTABEL F，et al.Regeneration of cassava plants from apical meristems[J].Plant science letters，1974，2（2）：107-113.

[4] LI H Q，SAUTTER C，POTRYKUS I，et al.Genetic transformation of cassava （Manihot esculenta Crantz） [J].Nature biotechnology，1996，14（6）：736-740.

[5] LI H Q，GUO J Y，HUANG Y W，et al.Regeneration of cassava plants via shoot organogenesis[J].Plant cell reports，1998，17（5）：410-414.

[6] STAMP J A，HENSHAW G G.Somatic embryogenesis in cassava[J].Zeitschrift für pflanzenphysiologie，1982，105（2）：183-187.

[7] STAMP J A，HENSHAW G G.Secondary somatic embryogenesis and plant regeneration in cassava[J].Plant cell，tissue and organ culture，1987，10（3）：227-233.

[8] SZABADOS L，HOYOS R，ROCA W.In vitro somatic embryogenesis and plant regeneration in cassava[J].Plant cell reports，1987，6（3）：248-251.

[9] RAEMAKERS C J J M，AMATI M，STARITSKY G，et al.Cyclic somatic embryogenesis and plant regeneration in cassava[J].Annals of botany，1993，71（4）：289-294.

[10] RAEMAKERS C J J M，BESSEMBINDER J J E，STARITSKY G，et al.Induction，germination and shoot development of somatic embryos in cassava[J].Plant cell，tissue and organ culture，1993，33（2）：151-156.

[11] SAELIM L，PHANSIRI S，NETRPHAN S，et al.Optimization of in vitro cyclic somatic embryogenesis and regeneration of the Asian cultivars of cassava （Manihot esculenta Crantz） for genetic manipulation system[J].Global journal of biotechnology & biochemistry，2006，1（1）：7-15.

[12] SUDARMONOWATI E，HENSHAW G G.The use of picloram and dicamba to induce somatic embryogenesis in cassava[J].Annales bogorienses，1996，4（1）：27-34.

[13] RAEMAKERS C J J M，SOFIARI E，JACOBSEN E，et al.Regeneration and transformation of cassava[J].Euphytica，1997，96（1）：153-161.

[14] SOFIARI E，RAEMAKERS C J J M，KANJU E，et al.Comparison of NAA and 2，4-D induced somatic embryogenesis in cassava[J].Plant cell，tissue and organ culture，1997，50（1）：45-56.

[15] 馬國華，許秋生，羨蘊蘭.從木薯嫩葉直接誘導初生體細胞胚胎發生和芽的形成[J].植物學報，1998，40（6）：503-507.

[16] 張紅巖，申乃坤，王溪森，等.木薯初生體細胞胚發生及植株再生的影響因素[J].廣西農業科學，2010，41（9）：882-885.

[17] MA G H，XU Q S.Induction of somatic embryogenesis and adventitious shoots from immature leaves of cassava[J].Plant cell，tissue and organ culture，2002，70（3）：281-288.

[18] LIN H S，TOORN C V D，RAEMAKERS K J J M，et al.Development of a plant regeneration system based on friable embryogenic callus in the ornamental Alstroemeria[J].Plant cell reports，2000，19（5）：529-534.

[19] TAYLOR N J，EDWARDS M，KIERNAN R J，et al.Development of friable embryogenic callus and embryogenic suspension culture systems in cassava （Manihot esculenta Crantz） [J].Nature biotechnology，1996，14（6）：726-730.

[20] TAYLOR N J，MASONA M V，CARCAMO R，et al.Production of embryogenic tissues and regeneration of transgenic plants in cassava （Manihot esculenta Crantz） [J].Euphytica，2001，120（1）：25-34.

[21] RAEMAKERS K，SCHREUDER M，PEREIRA I，et al.Progress made in FEC transformation of cassava[J].Euphytica，2001，120（1）：15-24.

[22] 方佳敏，劉佳，唐克軒，等.根癌農桿菌介導的木薯遺傳轉化條件的優化[J].熱帶作物學報，2011，32（9）：1697-1703.

[23] SHAHIN E A，SHEPARD J F.Cassava mesophyll protoplasts：Isolation，proliferation，and shoot formation[J].Plant science letters，1980，17（4）：459-465.

[24] ANTHONY P，DAVEY M R，POWER J B，et al.An improved protocol for the culture of cassava leaf protoplasts[J].Plant cell，tissue and organ culture，1995，42（3）：229-302.

[25] SOFIARI E，RAEMAKERS C J J M，BERGERVOET J E M，et al.Plant regeneration from protoplasts isolated from friable embroygenic callus of cassava[J].Plant cell reports，1998，18（1）：159-165.

[26] 文峰，肖詩鑫，聶揚眉，等.木薯脆性胚性愈傷組織原生質體培養與植株再生[J].中國農業科學，2012，45（19）：4050-4056.

[27] KYOZUKA J，OTOO E，SHIMAMOTO K.Plant regeneration from protoplasts of indica rice：Genotypic differences in culture response[J].Theoretical and applied genetics，1988，76（6）：887-890.

[28] RHODES C A，PIERCE D A，METTLER I J，et al.Genetically transformed maize plants from protoplasts[J].Science，1988，240（4849）：204-207.

[29] CHEN W H，DAVEY M R，POWER J B，et al.Sugarcane protoplasts：Factors affecting division and plant regeneration[J].Plant cell reports，1988，7（5）：344-347.

[30] CHANG Y F，WANG W C，WARFIELD C W，et al.Plant regeneration from protoplasts isolated from longterm cell cultures of wheat （Triticum aestivum L.） [J].Plant cell reports，1991，9（11）：611-614.

[31] MA Q X，ZHOU W Z，ZHANG P.Transition from somatic embryo to friable embryogenic callus in cassava：Dynamic changes in cellular structure，physiological status，and gene expression profiles[J].Frontiers in plant science，2015，6：824.

安徽農業科學2017年