乳寧合劑對乳腺癌小鼠癌組織VEGF及MVD表達影響的研究

石穎+楊江媛+何仕梅

摘要：目的觀察乳寧合劑對乳腺癌小鼠癌組織血管內皮生長因子（VEGF）表達和微血管密度（MVD）的影響。方法建立小鼠乳腺癌移植瘤模型，實驗分為乳腺癌模型組、參一膠囊組、乳寧合劑高、中、低劑量組。分組給藥21 d后，免疫組化法測定腫瘤組織中的VEGF和MVD。結果與模型組相比，乳寧合劑高、中劑量組及參一膠囊組均可明顯降低VEGF和MVD表達（P<0.05），其中以參一膠囊組作用最為明顯，乳寧合劑高、中劑量組次之，并呈劑量效應關系。結論乳寧合劑可能通過抑制腫瘤血管生成而發揮抗腫瘤效應。

關鍵詞：乳寧合劑；乳腺癌；血管內皮生長因子；微血管密度

中圖分類號：R285.5文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2017）04-0085-02

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌中具有特殊生物學行為和臨床病理特征的一種獨立類型，占乳腺癌總發病率的10～20.8%[1]。現有研究表明與非TNBC相比，TNBC具有侵襲性高、術后復發轉移風險高、疾病進展快、內臟轉移風險高等特點[2]，目前尚無明確針對TNBC的治療標準。

全國第四、第五批老中醫藥專家學術經驗繼承工作指導老師、云南省名中醫李斯文教授在三陰性乳腺癌的治療中主張從腎論治，以補腎活血方藥為主組成的乳寧合劑即為此而設。本實驗通過建立小鼠三陰性乳腺癌模型，采用免疫組化法檢測VEGF和MVD在腫瘤組織中的表達情況，探討乳寧合劑抗三陰性乳腺癌的作用機理。

1材料

1.1實驗動物與細胞系4～6周齡雌性BALB/c（nu/nu）小鼠，SPF級，體重18±2 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（京）2007-0001，飼養于中國科學院昆明動物研究所實驗動物中心。人TNBC細胞株MDA-MB-231購自中國科學院昆明動物研究所細胞培養中心。

1.2藥物中藥乳寧合劑主要由熟地、仙靈脾、菟絲子、枸杞子、丹參、郁金、莪術、八月札、薏苡仁、當歸等組成。以上中藥飲片均由云南省中醫醫院中藥房提供，由本院制劑室制備，制劑方法：將中藥浸泡2 h，常規煎煮3次，合并3次濾液，濃縮藥液濃度相當于3.2 g/mL，4℃冰箱保存。參一膠囊（吉林亞泰制藥股份有限公司，批號：20140910）。

1.3試劑ZLI一9032濃縮型DAB試劑盒、兔抗鼠CD34單克隆抗體由北京中杉金橋生物技術有限公司生產，批號：60882801。

1.4儀器電子天平JS1603-C：瑞士meittler公司；STPl20脫水機：MICROM公司；AF280—2包埋機：MICROM公司；HM335E切片機：MICROM公司；Nikon e.elipse 80i顯微鏡：Nikon公司；Carl Zeiss In--sing Systems：CarlZeiss公司；DRP-9052型電熱恒溫箱：上海森信實驗儀器有限公司；BG-270隔水式電熱恒溫箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

2方法

2.1乳腺癌小鼠模型制備、分組及給藥在無菌條件下，取處于對數生長期的TNBC MDA-MB-231細胞，調整細胞密度為 1×107個/mL，以0.2 mL/只的量接種于BALB/C雌性小鼠左側腋部皮下，待小鼠皮下實體瘤直徑長至5 mm時隨機分組給藥。參一膠囊組用生理鹽水配成5 mg/kg混懸液；乳寧合劑高、中、低劑量組分別以生理鹽水配成32 g/kg，16 g/kg，8 g/kg的藥液；以上各組均以10 mL/kg/只灌胃，每日1次；乳腺癌模型組每日給予等量生理鹽水灌胃。以上各組連續給藥3周。

2.2觀察指標測定

2.2.1瘤重、抑瘤率檢測持續灌胃21 d后次日處死小鼠，剝離瘤體，用電子天平稱取各組小鼠實體瘤重量（W），計算抑瘤率（I）[3]：I=（對照組W—治療組W）/對照組W×100%。

2.2.2小鼠瘤組織VEGF表達的測定瘤體取下后經10%甲醛固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，于腫瘤最大切面組織塊處做3～5um的連續切片，進行免疫組化染色。切片置于60℃烤箱烘烤2 h；切片脫蠟至水；蒸餾水洗2 min；高壓熱修復：高壓鍋內放適量自來水，將修復液倒入燒杯內，將燒杯置于高壓鍋內煮沸，將切片放入裝有修復液的燒杯內，加熱至設定壓力冒氣后持續2 min，自來水冷卻；3%H2O2溶液阻斷過氧化物酶10 min；PBS洗5 min×3次；滴加一抗，37℃孵育60分鐘；PBS洗5 min×3次；滴加二抗，37℃孵育60min；PBS洗5 min×3次；DAB顯色；復染、透明封片，鏡下觀察。

2.2.3小鼠瘤組織MVD計算VEGF免疫組化法染色后，先在低倍鏡（×100）下全面觀察切片以確定腫瘤內血管密度最高處，高血管密度區多位于腫瘤邊緣。在高倍鏡（×400）下，以腫瘤內任何一個棕色染色的內皮細胞或細胞叢作為一個血管，只要結構不相連，其分支結構也作為一個血管計數。記錄5個視野內的微血管個數，取其平均數作為該切片MVD值。

2.3統計學方法計量資料以均值±標準差（x±s）表示，采用SPSSl3.0統計軟件包統計數據，多組間比較用方差分析，然后用LSD法進行組間兩兩比較，P<0.05為有統計學意義。

3結果

3.1乳寧合劑對小鼠移植瘤的抑瘤作用結果見表1。

3.2乳寧合劑對荷瘤小鼠腫瘤組織VEGF、MVD的影響結果見表2。

由表2可知，乳寧合劑各劑量組和參一膠囊組的VEGF、MVD表達均小于模型組，其中乳寧合劑高、中劑量組VEGF、MVD與模型組相比有統計學意義（P<0.05）。提示乳寧合劑對MDA-MB-23乳腺癌移植瘤VEGF、MVD的表達有抑制作用，高劑量組作用較為明顯。

4討論

Hanahan等[4]于1996年提出血管生成的開關平衡假說，認為血管生成受血管生成促進因子和血管生成抑制因子的共同調控。血管內皮生長因子（VEGF）是目前研究最廣泛、作用最強的血管生成正調控因子。它主要通過自分泌或旁分泌與內皮細胞上的相應受體（VEGFR）結合，促進血管內皮細胞分化、增殖、遷移，增加毛細血管通透性，刺激腫瘤新生血管生成[5～6]。微血管密度（MVD）直接量化反映腫瘤血管生成的程度，不僅與腫瘤細胞的營養和供氧有關，而且反映了腫瘤的侵潤和轉移能力[7]。由于三陰性乳腺癌較高的侵襲、轉移特性，抗腫瘤血管生成對三陰性乳腺癌的治療具有重要意義。故本文選擇VEGF、MVD為觀察指標，探討了不同劑量的乳寧合劑對三陰性乳腺癌組織血管生成的影響。

在多年的腫瘤防治工作中，云南省名中醫李斯文教授體會到肝脾腎、沖任二脈功能失調與乳腺癌的發病密不可分，其中尤以腎居于核心地位。李斯文教授認為，腎水虧虛，則肝木失于涵養，其調達之性不能伸展，易于怫郁，氣滯日久，木壅侮土，脾胃受損，脾失健運，痰濕內聚，氣機不暢，血滯為瘀，痰瘀膠結，循厥陰之脈聚于乳房而成癥瘕。腎主生殖，為沖任之本，腎虛則肝脾、沖任易病，腎強則肝脾、沖任易調。因此，在治療中堅持“腎為核心”、“益腎為先”的治療原則，并貫徹病程治療始終。李教授還認為腎元虧虛是乳腺癌發病的始動因素，由其導致的瘀血阻滯在疾病的發生發展過程中占有重要地位。以補腎為基礎的補腎活血法是乳腺癌治療的重要法則，凝聚李斯文教授多年臨床經驗的乳寧合劑即為此而設。

實驗研究結果表明，與模型組比較，乳寧合劑高、中劑量組和參一膠囊組均能夠明顯降低移植瘤組織VEGF表達和MVD（P<0.05），而以參一膠囊組作用最強，乳寧合劑高劑量組次之。初步證實了乳寧合劑通過降低腫瘤組織VEGF表達、MVD而抑制TNBC微血管的生成。此研究結果為進一步展開乳寧合劑抗腫瘤及其抗腫瘤血管生成研究奠定了基礎。從微觀上證實了從補腎活血治療TNBC的可行性，為臨床預防TNBC的轉移和復發提供了新的思路和方法。

參考文獻：

[1]Amirikia KC，Mills P，Bush J，et al.Higher population-based incidence rates of triple-negative breast cancer among young African Amerian women：implication for breast cancer screening recommendations[J].Cancer，2011，117（2）：2747-2753.

[2]顧軍，于澤平，李寧.三陰性乳腺癌的研究進展[J].醫學研究生學報，2010，23（1）：105-106.

[3]Lud GD.Baylin SB.Successful Treatment with DL-α-difluo-romethyl-ornithine in established Human small cell variang luang carcinmoma impl-ants in athymic mice[J].Cancer Res，1983，43：4239-4243.

[4]Hanahan D，Folkman J.Patterms and emerging mechanisns of the angio-genic seich during tumorigegenesis[J].Cell，1996，86（3）：353-364.

[5]Frelin C，Ladoux A，D，angelo G.Vascular endothelial growth factors and angiogenesis[J].Ann Endothelial Paris.2000，61（1）：70-74.

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[7]Zolota V，Gerokosta a，Melachrinou M，et al.Microvessel density，proliferating activity，P53 and bcl-2 expression in situ ductal carcinoma of the breast[J].Pediatrics，1999，103：1145-1149.