長鏈非編碼RNA LOC285194在乳腺癌組織中的表達及臨床意義

黃秋霞，陳 罡，馮震博，韋康來，陳 皓

(廣西醫科大學第一附屬醫院病理科，南寧 535021)

長鏈非編碼RNA LOC285194在乳腺癌組織中的表達及臨床意義

黃秋霞，陳 罡△，馮震博，韋康來，陳 皓

(廣西醫科大學第一附屬醫院病理科，南寧 535021)

[摘要] 目的 探討長鏈非編碼RNA(lncRNA) LOC285194在乳腺癌及癌旁組織中的表達及其臨床意義。方法 選取石蠟包埋的乳腺癌組織42份及癌旁組織16份，用實時熒光定量PCR技術檢測lncRNA LOC285194的表達，分析其與臨床病理特征的相關性。結果 lncRNA LOC285194在乳腺癌組織中表達水平明顯低于癌旁組織(P<0.01)；lncRNA LOC285194在人類表皮生長因子受體2(HER2)過表達乳腺癌組織較HER2陰性乳腺癌組織表達水平上調(P=0.013)，二者呈正相關(r=0.385,P=0.012)。結論 lncRNA LOC285194可能在乳腺癌起抑癌基因的作用，可能是通過與HER2的關聯參與乳腺癌的發生，其有可能成為乳腺癌治療的靶基因。

乳腺腫瘤；長鏈非編碼RNA；LOC285194；腫瘤發生； 人類表皮生長因子受體2

乳腺癌是危害女性健康常見的惡性腫瘤，其具有異質性強的特點，具有多種組織學分類，有研究顯示，通過基因譜改變進行分子分類，相對組織學分類更為精確、有效，因此尋求特異性強的分子診治靶標可為乳腺癌的診療提供更有效的新方案。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度大于200 bp，無編碼蛋白質功能的RNA，參與腫瘤的發生、發展[1]。lncRNA在乳腺癌中有異常表達，影響乳腺癌細胞的增殖、轉移等。lncRNA LOC285194是近年來新發現在腫瘤中異常表達的基因，其在乳腺癌中表達情況少見報道。本研究通過檢測lncRNA LOC285194在乳腺癌及癌旁組織中的表達，分析其與各臨床病理特征的相關性，探討lncRNA LOC285194在乳腺癌發生、發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院病理科2012年1-12月行乳腺癌根治術的石蠟標本，包括42份癌組織及16份癌旁組織，患者術前均未進行輔助性的放療或化療。病理類型為浸潤性導管癌，癌旁組織距離腫瘤至少5 cm。并收集相關臨床病理資料，包括年齡、腫瘤TMN分期、免疫組化結果等。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 在本組實驗中癌組織成分大于等于50%的，切片厚度為6 μm 3片；癌組織成分小于50%及癌旁組織，均為切片厚度8 μm 5片。當脂肪面積達大于等于30%的癌及癌旁組織，需將切片置于玻片上，根據HE鏡下定位，用蓋玻片剔除多余的脂肪組織，盡量保證提取總RNA為腺體的。其后操作步驟按miRNeasy FFPE Kit (QIAGEN)的試劑盒說明書進行。經用核酸檢測儀檢測總RNA達使用標準(A260∶A280為1.9～2.1)的標本方能使用。

1.2.2 cDNA合成 使用miScript Ⅱ RT Kit (QIAGEN)試劑盒，按20 μL反應體系，經普通PCR 37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min逆轉錄，4 ℃保存。其中5×miScript HiFlex Buffer 4 μL，10×Nucleics Mix 2 μL，RNase-free water variable，miScriptReverse Transcriptase Mix 2 μL，Template RNA variable，總容積總容量20 μL。

1.2.3 qRT-PCR 檢測 使用LightCycler?480 SYBR Green I Master(Roche)試劑盒，按20 μL反應體系，參照說明書步驟進行。其中dH2O 6 μL，SYBR Green I Master 10 μL，PCR Forward Primer 1 μL，PCR Reverse Primer 1 μL，DNA 模板2 μL，總容積總容量20 μL。引物序列 lncRNA LOC285194上游：5′- TGT GCC TGT TTG ACC TCT GA-3′， 下游：5′-AGG AAG GAT AAA AGA CCG ACC A-3′。

1.3 統計學處理 數據采用SPSS16.0統計軟件進行分析。本實驗采用計算2-△Ct值的方法來進行各標本的相對定量檢測[2]。組間比較采用秩和檢驗。記數資料采用χ2檢驗，lncRNA LOC285194表達與各臨床病理特征的相關性采用Spearman相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 qRT-PCR擴增曲線和溶解曲線 GAPDH及lncRNA LOC285194 Ct值為25～35。擴增曲線出現平臺期，各組擴增效率相近。

2.2 qRT-PCR檢測結果 以癌和癌旁2-△Ct的中位數分界，將lncRNA LOC285194表達分為高表達組及低表達組。經秩和檢驗分析，在癌組織中lncRNA LOC285194的表達水平較癌旁組織明顯降低(P<0.01)，見表1。lncRNA LOC285194的表達水平在HER2過表達，即HER2(3+)的乳腺癌組織中較HER2陰性的乳腺癌組織表達明顯上調(P=0.013)，見圖1。相關性分析顯示，lncRNA LOC285194的表達水平與HER2過表達呈正相關(r=0.385,P=0.012)，其余臨床病理特征指標中lncRNA LOC285194的表達水平差異無統計學意義(P>0.05) ，見表2。

表1 lncRNA LOC285194在乳腺癌和癌旁組織中的表達比較[n(%)]

A：HER2 (-)；B：HER2 (3+)。

表2 LOC285194的表達水平與乳腺癌臨床病理特征的相關性[n(%)]

3 討 論

乳腺癌近年來發病率不斷上升，患者發病年齡呈年輕化趨勢。在美國2014 年乳腺癌的新發病例為234 190例，其中女性231 840例；死亡人數40 730例，其中女性為40 290例，死亡率在女性惡性腫瘤中位居第2位[3]?！?014年中國腫瘤登記年報》顯示，乳腺癌的發病人數約為25萬，居女性惡性腫瘤發病率第1位，死亡率在女性惡性腫瘤中占第4位，嚴重威脅女性健康和生命[4]。隨著分子病理學技術的發展，研究發現多個lncRNA與乳腺癌的發生、發展具有密切關聯[5-13]，如HOTAIR影響乳腺癌的轉移，H19影響乳腺癌細胞周期，Gas5、Zfas1、LSINCT5影響乳腺癌細胞增殖等，這些研究提示lncRNA可能為乳腺癌的診治帶來新的思路，發現對乳腺癌細胞特異性高的lncRNA對推動乳腺癌精準治療具有重大意義。

LOC285194是位于染色體3q13.31的一個反義lncRNA，Pasic等[14]首次在骨肉瘤組織中發現并命名。在骨肉瘤[14]、結直腸癌[15]、食管癌[16]、胰腺癌[17]、膠質瘤[18]的研究中，均顯示在腫瘤組織中LOC285194表達水平降低或缺失，且與患者的不良預后相關，起著抑癌基因的作用。其低表達與腫瘤大小、臨床分期、淋巴結轉移和遠處轉移相關[14-18]。LOC285194抑癌作用的機制，在骨肉瘤中，主要通過對細胞周期、細胞凋亡及VEGF/VEGFR1的調節，進而影響骨肉瘤細胞的增殖性[14]。在結直腸癌中，LOC285194受到抑癌基因P53的調節，且和潛在癌基因miRNA-211競爭靶點抑制細胞增殖[19]。在膠質瘤的研究中，上調LOC285194可增加P53蛋白的表達量[18]。由此可見，LOC285194在腫瘤中可能通過與P53相互作用，調控相關基因的表達，抑制腫瘤細胞的增殖性，從而起到抑癌的作用。

本研究結果顯示，LOC285194在乳腺癌中的表達，較癌旁組織表達水平明顯下降，與之前在其他腫瘤中的結果一致。同時，試驗結果顯示，LOC285194在HER2過表達較HER2陰性的乳腺癌組織表達上調。而HER2作為乳腺癌靶向用藥的臨床指標，與LOC285194存在相關性的發現，使LOC285194進一步深入研究具有重大的意義。而其是否也通過P53、miRNA-211影響乳腺癌細胞的增殖性，需要進一步的研究證實。

綜上所述，LOC285194在乳腺癌中可能起著抑制癌的作用，與HER2的表達存在相關性，可望成為乳腺癌診斷的分子標記物及治療的靶點。

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Expression and clinical significance of long chain non-coding RNA LOC285194 in human breast cancer tissue

HuangQiuxia,ChenGang△,FengZhenbo,WeiKanglai,ChenHao

(DepartmentofPathology,FirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China)

[Abstract] Objective To investigate the expression of long chain non-coding(lnc) RNA LOC285194 in breast cancer tissue and paracancerous tissue and its clinical significance.Methods Forty-two samples of paraffin embedded breast cancer tissue and 16 samples of paraffin embedded paracancerous tissue were selected.The expression of lncRNA LOC285194 in these tissue were detected by using quantitative real-time polymerase chain reaction(PCR).Then its correlation with clinicopathological features was analyzed.Results The expression level of lncRNA LOC285194 in breast cancer tissue was significantly lower that in the paracancerous tissue (P<0.01);the level of lncRNA LOC285194 in human epidermal growth factor receptor-2(HER2)overexpression tissues was up-regulated compared with HER2 negative breast cancer tissue(P=0.013),there was a positive correlation between them(r=0.385,P=0.012).Conclusion lncRNA LOC285194 may play the role of cancer suppressor gene and may be involved in the generation of breast cancer by HER2 association,which may become a target gene of breast cancer treatment.

breast neoplasms;long chain non-coding RNA;LOC285194;tumorigenesis;human epidermal growth factor receptor-2

黃秋霞(1981-)，主治醫師，碩士研究生，主要從事腫瘤病理診斷及基礎研究?！?/p>

，E-mail:1055668952@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.09.024

R73-35

A

1671-8348(2017)09-1223-03

2016-07-20

2016-11-18)

論著·臨床研究